細胞生物學實驗報告

細胞生物學實驗報告

細胞生物學實驗報告

動物細胞融合

【實驗目的】

⒈了解動物細胞融合的常用方法。⒉學習化學融合的基本操作過程。

⒊觀察動物細胞融合過程中細胞的行為和變化。

【實驗原理】

細胞融合是指在自發(fā)或者誘導條件下，兩個或兩個以上細胞合并為雙核或者多核細胞的過程。目前人們已經發(fā)現(xiàn)有很多方法可以誘導細胞融合，包括病毒誘導融合、化學誘導融合和電激誘導融合。

⒈病毒誘導融合

仙臺病毒、牛痘病毒、新城雞瘟病毒和皰疹病毒等可以介導細胞的融合。這類病毒的被膜中含有融合蛋白，可介導病毒和宿主細胞融合，同時也可介導細胞與細胞的融合。用紫外線滅活后，這些病毒即可誘導細胞發(fā)生融合。

⒉化學誘導融合

很多化學試劑能夠誘導細胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亞砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰絲氨酸等。這些物質能夠改變細胞膜脂質分子的排列，在去除這些物質之后，細胞膜趨向于恢復原有的有序結構。在恢復過程中相接觸的細胞由于接口處脂質雙分子層的相互親和與表面張力，細胞膜融合，胞質流通，發(fā)生融合�；瘜W誘導方法，操作方便，誘導融合的概率比較高，效果穩(wěn)定，適用于動、植物細胞，但對細胞具有一定的毒性。PEG是被廣泛使用的化學融合劑。

⒊電激誘導融合

包括電誘導、激光誘導等。其中，電誘導是先使細胞在電場中極化成為偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強度、短時程的電脈沖擊破細胞膜，細胞膜的脂質分子發(fā)生重排，由于表面張力的作用，兩細胞發(fā)生融合。電誘導方法具有融合過程易控制、融合概率高、無毒性、作用機制明確、可重復性高等優(yōu)點。

【實驗用品】

⒈材料

雞血紅細胞。⒉試劑

50%PEG、Hank’s溶液(pH7.4)、Alsever’s細胞保存液、0.85%氯化鈉溶液。⒊器材

正置顯微鏡、離心機、離心管、載玻片、蓋玻片、滴管、注射器等。

【實驗步驟】

⒈雞血紅細胞的制備和保存

用無菌注射器先吸入Alsevers溶液1ml，再從雞翼下靜脈取血0.5~1ml，取出后放入刻度離心管中，再加入2~3mlAlsevers溶液，使總量為4~5ml，混勻并封口，置于4℃冰箱內。

⒉PEG誘導融合

⑴取保存的雞血，離心去除Alsevers溶液，以0.85%氯化鈉溶液配制成5%~10%的懸液。

⑵稱取1gPEG放入試管內，在沸水浴中融化后，加入1ml預熱的Hank’s溶液，混勻，制成50%的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。

⑶取上述雞紅細胞懸液1ml放入離心管中，再加入5mlHank’s溶液混勻，然后以1000r/min離心5min，小心棄去上清液，用指彈法將細胞團塊彈散。

⑷取上述50%PEG溶液1ml，在1min內滴加到雞紅細胞懸液中，邊加邊輕輕搖動混勻。待PEG全部加入后靜置2~5min左右。

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⑸緩慢滴加6mlHank’s溶液以終止PEG的作用，混勻，靜置5min。

⑹1000r/min離心3min，棄上清液后，取一滴融合后的細胞懸液滴片，加蓋玻片鏡檢。

【實驗結果】

【分析與討論】

⒈結果分析

視野中有部分細胞出現(xiàn)融合現(xiàn)象，但是沒有觀察到細胞核。此外，視野中有些細胞發(fā)生重疊，是由于稀釋不足造成的。

⒉注意事項

⑴制備的雞血紅細胞懸液的濃度不宜過高，否則細胞容易聚集，融合效果受影響。

⑵在離心之前，為了防止損壞儀器，應配平離心機。具體方法為：把相對的兩個皮套放在天平上秤，在皮套中央各放置一個空的離心管，通過調節(jié)離心管中水的量來使天平達到平衡。

⑶在制片之前，應對細胞懸液進行充分稀釋，以免細胞發(fā)生重疊，影響觀察。⑷在制片之后，如雞血紅細胞懸液過多，則應用吸水紙吸去，以免弄臟物鏡。⑸為了觀察清楚，應把光線調暗，并改用小光圈。

【相關鏈接】

細胞融合技術的應用

⒈植物體細胞雜交

植物體細胞雜交（plantsomatic

hybridization）,又稱原生質體融合（Protoplastfusion）是指將植物不同種、屬，甚至科間的原生質體通過人工方法誘導融合，然后進行離

體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術。植物細胞具有細胞壁，未脫壁的兩個細胞是很難融合的，植物細胞只有在脫去細胞壁成為原生質體后才能融合，所以植物的細胞融合也稱為原生質體融合。

⒉單克隆抗體

單克隆抗體是由淋巴細胞雜交瘤產生的、只針對復合抗原分子上某一單個抗原決定簇的特異性抗體。淋巴細胞雜交瘤是用人工方法使骨髓瘤細胞（純系小鼠的腹水瘤型漿細胞）與已用抗原致敏并能分泌某種

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抗體的淋巴細胞（常用致敏動物的脾細胞，起作用的是其中的B細胞）融合而成的。用來使上述淋巴細胞致敏的抗原有人和動物的T細胞、B細胞、紅細胞、腫瘤細胞、各種微生物或其他抗原物質等。這種融合細胞既具有腫瘤細胞能大量、無限繁殖的特性，又具有B細胞能合成分泌特異性抗體的能力。由于一個B細胞克隆只針對一個

抗原決定簇產生相對應的抗體，所以一個B細胞與骨髓瘤細胞融合而成的單個雜交瘤細胞，也只產生某種單一的抗體。采用適當方法把雜交瘤細胞分離出來，進行單個細胞培養(yǎng)，使之大量繁殖，則在該培養(yǎng)液中增殖而形成的細胞克隆，只產生完全均一的、單一特異性的抗體，即單克隆抗體。若把能產生特異性抗體的單克隆雜交瘤進行大量培養(yǎng)，或注入原系動物腹腔中，則雜交瘤仍以腹水型方式生長，在培養(yǎng)液或腹水中會含有大量單克隆抗體。用雜交瘤技術制備出來的單克隆抗體純度高、專一性強、效價高，使用時可免除不同細胞及微生物種或株間血清學上的交叉反應，大大提高了診斷的特異性及敏感性。另外，在研究細胞表面標志、提純可溶性抗原、進一步研究抗體的結構和功能等方面都起著十分重要的作用。

⒊細胞治療

將自體細胞取出，經培養(yǎng)3-5周后再移植（注射）到自體的病患部位，達到替代受損細胞修復之目的，細胞治療有長期的效果，細胞能釋放自身的愈合和再生能力，治療疾病（腫瘤；臟器；器官；疤痕；皺紋;皮膚化等）。

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⒋核移植

核移植是將供體細胞核移入去核的卵母細胞中，使后者不經精子穿透等有性過程即可被激活、分裂并發(fā)育，讓核供體的基因得到完全復制。培養(yǎng)一段時間后，在把發(fā)育中的卵母細胞移植到人或動

物體內的方法。核移植的細胞來源主要分為：供體細胞來源和受體細胞的來源兩種。核移植主要用于細胞移植和異種器官移植，細胞移植可以治療由于細胞功能缺陷所引的各種疾病。

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