細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

小鼠脾細(xì)胞原代培養(yǎng)

姓名：杜旭學(xué)號(hào)：201*00230155系年級(jí)：201*級(jí)臨七一班同組者：趙偉日期：201*/4/25

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

⒈學(xué)習(xí)并掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)。⒉了解原代細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法及操作過程。⒊學(xué)習(xí)細(xì)胞計(jì)數(shù)及營養(yǎng)液的配制。

【實(shí)驗(yàn)原理】

⒈細(xì)胞原代培養(yǎng)

原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從動(dòng)物體內(nèi)獲取的細(xì)胞、組織和器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后，直到第一次傳代為止。這種培養(yǎng)，首先用無菌操作的方法，從動(dòng)物體內(nèi)取出所需的組織（或器官），經(jīng)消化，分解成單個(gè)游離細(xì)胞，在人工培養(yǎng)下，使其不斷的生長(zhǎng)及繁殖。

細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)，必須滿足兩個(gè)基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必須的條件，如適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長(zhǎng)因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度與滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。

⒉細(xì)胞死活鑒定死活細(xì)胞的鑒定方法有很多種，常用的有染色法和儀器分析法。染色法是常用的細(xì)胞死活鑒定方法，簡(jiǎn)便，易于操作。不同的死活細(xì)胞鑒定方法有各自不同具體的反應(yīng)機(jī)理，但無論采用何種辦法，都是利用了死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異。

染色法分化學(xué)染色法和熒光染色法，根據(jù)染色機(jī)理的不同，染料或使死細(xì)胞著色，或使活細(xì)胞著色�！袼阑罴�(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異主要包括：

☆死活細(xì)胞細(xì)胞膜通透性的差異：活細(xì)胞的細(xì)胞膜是一種選擇性膜，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性的通過；而細(xì)胞死亡之后，細(xì)胞膜受損，通透性增加。常用的以臺(tái)盼藍(lán)鑒別細(xì)胞死活的方法就是利用了這一性質(zhì)。臺(tái)盼藍(lán)，又稱錐藍(lán)，是一種陰離子型染料，不能透過完整的細(xì)胞膜。所以經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后只能使死細(xì)胞著色，而活細(xì)胞不被著色。甲基藍(lán)有類似的染色機(jī)理。植物細(xì)胞的質(zhì)壁分離也可鑒定死活。

☆死活細(xì)胞在代謝上的差異：是采用美藍(lán)染料鑒定酵母細(xì)胞死活的依據(jù)。美藍(lán)是一種無毒染料，氧化型為藍(lán)色，還原型為無色。由于活細(xì)胞中新陳代謝的作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)色的氧化性變?yōu)闊o色的還原型，因此美藍(lán)染色后活的酵母細(xì)胞無色；而死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們的無還原能力或還原能力極弱，使美藍(lán)處于氧化態(tài)，從而被染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。

除此之外，還有一些細(xì)胞器的專有染料。如液泡系的專有染料中性紅。中性紅是一種低毒性染料，可以使活細(xì)胞液泡著紅色，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核不被著色；死細(xì)胞的液泡不被著色或淺染，染料彌散于整個(gè)細(xì)胞中，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被染成紅色。有時(shí)侯為了增加染色效果可以將兩種染料結(jié)合使用，如甲基藍(lán)-中性紅混合染色法。

【實(shí)驗(yàn)用品】

⒈材料小白鼠⒉試劑

臺(tái)盼藍(lán)、伊紅、PBS緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)液（含生長(zhǎng)因子）⒊器材

剪子、棉球、75%酒精、移液槍、無菌操作臺(tái)、正置光學(xué)顯微鏡、倒置光學(xué)顯微鏡、解剖盤、滴管、離

第1頁細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

心管、離心機(jī)、注射器、Eppendorf管、培養(yǎng)皿、酒精燈、塑料培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板

【實(shí)驗(yàn)步驟】

⒈取材

取小鼠一只，采用斷頭法處死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)內(nèi)的解剖盤中，無菌操作打開腹腔，取出其脾臟，除去其周圍的脂肪組織，并用PBS液自上而下淋洗1-2次，轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中待用。

⒉分離脾細(xì)胞

用滴管向培養(yǎng)皿中注入30滴PBS緩沖液，再用“L”型針頭注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾臟，注射時(shí)沿長(zhǎng)軸注射。然后再用針頭在脾臟上扎眼，并用“L”型針頭輕輕刮出脾細(xì)胞。在均勻吹勻脾臟細(xì)胞。

吸取上述分離的單個(gè)脾細(xì)胞懸液，放入Eppendorf管中，使量至1mL，以1000r/min離心5min。⒊培養(yǎng)脾細(xì)胞

取塑料培養(yǎng)皿一套，用移液槍吸取培養(yǎng)液2mL加入塑料皿中，并將皿標(biāo)記待用。取離心后的Eppendorf管，棄去上清液，用移液槍（200ul）吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ul加入棄去上清的Eppendorf管中，用槍頭吹勻管底的脾細(xì)胞，吸取200ul脾細(xì)胞懸液接種于上述塑料皿中，混勻后放入37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

⒋配制染液

用生理鹽水配成5%臺(tái)盼藍(lán)染液，備用。⒌染色

取0.5mL細(xì)胞懸濁液放入試管中，加入1-2滴染液�；旌�。2-5min后將細(xì)胞放在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上觀察死活情況，注意不要有

氣泡產(chǎn)生，放大倍數(shù)為10x10。染色后活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞顯示藍(lán)色。注意染色時(shí)間不能超過15min，否則染液將細(xì)胞毒殺。

⒍計(jì)數(shù)

在10x10倍的顯微鏡下觀察，計(jì)算血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的4個(gè)4小方格的細(xì)胞數(shù)量。包括細(xì)胞總數(shù)與死細(xì)胞數(shù)量。壓線者計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右。

⒎計(jì)算細(xì)胞活力

根據(jù)公式：細(xì)胞活力=(總細(xì)胞數(shù)-死細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100%

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

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細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

臺(tái)盼藍(lán)染色后的細(xì)胞（10x10）伊紅染色后的細(xì)胞（10x10）

總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)表（10×10）

項(xiàng)目自己培養(yǎng)細(xì)胞老師培養(yǎng)細(xì)胞總細(xì)胞數(shù)個(gè)/ml活細(xì)胞數(shù)個(gè)/ml細(xì)胞活力1.4×1067.5×1053.0×1055.5×10521.4%73.3%【分析與討論】

⒈結(jié)果分析

本次實(shí)驗(yàn)中我們小組自己培養(yǎng)細(xì)胞所測(cè)細(xì)胞活力為21.4%，并不算高，分析得應(yīng)有以下原因可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（包括誤差）：

⑴若在無菌操作的過程中操作不規(guī)范，導(dǎo)致染菌，會(huì)極大的影響觀察，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

⑵若在離心分離呈單細(xì)胞的過程中離心機(jī)轉(zhuǎn)速過快或時(shí)間過長(zhǎng)很可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破裂，導(dǎo)致小鼠脾細(xì)胞大量死亡。

⑶染色時(shí)間過長(zhǎng)，或觀察時(shí)間過長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致染色試劑將細(xì)胞殺死，使細(xì)胞活力驟降，這是導(dǎo)致細(xì)胞活力比較低的重要原因。

⑷實(shí)驗(yàn)中的一些操作不正確或不規(guī)范的情況、計(jì)算帶來的誤差等也會(huì)直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。⒉注意事項(xiàng)

⑴嚴(yán)格進(jìn)行動(dòng)物消毒，需用75%酒精消毒。

⑵嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，防止細(xì)菌、霉菌、支原體污染，避免化學(xué)物質(zhì)污染。⑶吸取液體前，瓶口和吸管硬行火焰消毒；吸取液體時(shí)，避免碰撞。⑷離心管入臺(tái)前，管口、管壁應(yīng)消毒。

⑸實(shí)驗(yàn)者離開超凈臺(tái)時(shí)，要隨時(shí)用肘部關(guān)閉工作窗。

⑹器材使用時(shí)既要注意用火焰消毒，又要防止?fàn)C傷、燙死細(xì)胞。

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實(shí)驗(yàn)六細(xì)胞膜的滲透性

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解細(xì)胞膜[1]的滲透性及各類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度[2]

二、實(shí)驗(yàn)原理

1、在等滲溶液中，細(xì)胞對(duì)各種溶質(zhì)的透過性不同。有的溶質(zhì)可以進(jìn)

入，有的溶質(zhì)不能滲入。

2、滲入的溶質(zhì)能提高細(xì)胞的滲透壓，促進(jìn)水分子進(jìn)入細(xì)胞，引起溶

血現(xiàn)象[3]。

3、不同的溶質(zhì)滲入到細(xì)胞內(nèi)的速度不同，因此溶血時(shí)間也不同。

三、實(shí)驗(yàn)材料

新鮮血液（雞血、豬血、牛血等）

四、實(shí)驗(yàn)器材

試管（1.5cmX18cm）、試管架、10ml移液管、1ml移液管、200ml燒杯（2個(gè)）、250ml容量瓶、移液槍、膠頭滴管、菜刀、吸球、電子天平、顯微鏡、蓋玻片、載玻片、秒表

五、實(shí)驗(yàn)藥品及試劑0.17MNaCl、0.17MNH4Cl、0.17MNH4Ac、0.17MNaNO3、0.12MNa2SO4、0.12M草酸銨、0.32M葡萄糖、0.32M甘油、0.32M乙醇、0.32M丙酮、肝素抗凝劑[4]

六、實(shí)驗(yàn)步驟1、制備血液稀釋液

（1）抗凝劑的制備：首先稱取1克肝素鈉粉末，然后加入0.17M

NaCl溶液10ml（1∶10的比例），混合均勻，制成肝素抗凝劑。

（2）血液稀釋液的制備：取新鮮血液，按比例（肝素抗凝劑:血液

=1∶10）混合均勻，配制成經(jīng)肝素抗凝的血液[5][6]。

（3）按比例（經(jīng)肝素抗凝的血液∶0.17MNaCl溶液=1∶10）混

合均勻，形成一種不透明的紅色液體[7]。

2、低滲溶液（空白對(duì)照）的觀察

取試管一只，加入10ml蒸餾水，然后再加入1ml稀釋的血液。注意觀察溶液顏色的變化。結(jié)果是溶液由不透明的紅色變?yōu)槌吻�。記錄下這個(gè)過程所要的時(shí)間。3、紅血球的滲透性

按表一的配制，分別在下列十種等滲溶液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。輕輕搖動(dòng)，注意有無顏色變化，是否有溶血現(xiàn)象發(fā)生，記下時(shí)間（自加入稀釋血液到溶液逐漸由紅色變?yōu)橥该鞒吻�，紅血球全部溶血所需時(shí)間），填入表一的空格中。4、顯微觀察

[1]何為細(xì)胞膜？[5]注意：這一步，動(dòng)作要非常迅速，否則雞血會(huì)凝固�；蛘呦劝芽鼓齽┘尤氲綗�杯中，再加入新鮮的[2]雞血，邊加邊震蕩即可。為何不同物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度不同？[6]為什么新鮮的雞血會(huì)凝固？[3]何為溶血現(xiàn)象？[7]為什么這一步要使用0.17M的NaCl溶液？[4]你知道有哪些血液抗凝劑？（1）血液紅細(xì)胞的觀察

滴一滴稀釋的血液于載玻片上，蓋上蓋玻片。用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的種類、形狀和顏色。

（2）細(xì)胞破碎的觀察

在上一步的載玻片的一端滴加清水，在另一端吸水，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞的破裂。

七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

1、比較和分析你所觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并解釋原因。

結(jié)果：

（1）在所提供的試劑中不溶血的有：

（2）在所提供的試劑中不完全溶血的有：（3）在所提供的試劑中完全溶血的有：結(jié)果分析與比較：結(jié)論：

2、繪制你所觀察到的血液細(xì)胞圖。

3、討論溶血實(shí)驗(yàn)在研究中應(yīng)用的可能性。附1：試劑配制表

1、0.17MNaCl需要＿＿＿＿＿＿克NaCl，定容至100ml。2、0.17MNH4Cl需要＿＿＿＿＿＿克NH4Cl，定容至100ml。3、0.17MNH4Ac需要＿＿＿＿＿＿克NH4Ac，定容至100ml。4、0.17MNaNO3需要＿＿＿＿＿＿克NaNO3，定容至100ml。5、0.12MNa2SO4需要＿＿＿＿＿＿克Na2SO4，定容至100ml。6、0.12M草酸銨需要＿＿＿＿＿＿克草酸銨，定容至100ml。7、0.32M葡萄糖需要＿＿＿＿＿＿克葡萄糖，定容至100ml。8、0.32M甘油需要＿＿＿＿＿＿克甘油（100%），定容至250ml。9、0.32M乙醇需要＿＿＿＿＿＿克無水乙醇，定容至250ml。10、0.32M丙酮需要＿＿＿＿＿＿克丙酮，定容至250ml。

附2：表一在不同低滲溶液下溶血現(xiàn)象的調(diào)查

編號(hào)12345678910試劑10ml0.17MNaCl+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNH4Cl+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNH4Ac+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNaNO3+1ml稀釋的雞血10ml0.12MNa2SO4+1ml稀釋的雞血10ml0.12M草酸銨+1ml稀釋的雞血10ml0.32M葡萄糖+1ml稀釋的雞血10ml0.32M甘油+1ml稀釋的雞血10ml0.32M乙醇+1ml稀釋的雞血10ml0.32M丙酮+1ml稀釋的雞血是否溶血時(shí)間

附3：溶血結(jié)果的判斷

（1）不溶血：液體分2層，上層淺黃色透明，下層紅色不透明，鏡檢紅細(xì)胞完好。（2）不完全溶血：溶液混濁，上層變紅色，鏡檢有部分紅細(xì)胞破裂。（3）完全溶血：液體變紅而且透明，鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全成碎片。

附4：細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)交換示意圖

原始生命向細(xì)胞進(jìn)化所獲得的重要形態(tài)特征之一，是生命物質(zhì)外面出現(xiàn)了一層膜性結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜。細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)總稱為生物膜(biomembrane)。

細(xì)胞膜(cellmembrane)，又稱原生質(zhì)膜，是細(xì)胞結(jié)構(gòu)中分隔細(xì)胞內(nèi)、外不同介質(zhì)和組成成分的界面。其厚度通常為7～8nm，由脂類和蛋白質(zhì)組成。一般蛋白質(zhì)占60%-80%，類脂占20%-40%，碳水化合物約占5%。關(guān)于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)模型，流體鑲嵌模型是目前被最廣泛接受和認(rèn)可的觀點(diǎn)。該模型由美國加州大學(xué)的辛格(S.J.Singer)和尼克森(G.L.Nicolson)于1972年提出。該模型突出了膜的流動(dòng)性和不對(duì)稱性，其結(jié)構(gòu)特征是：生物膜的骨架是磷脂雙分子層，其中磷脂分子的疏水性尾部相對(duì)，極性頭部朝向水相。蛋白質(zhì)或嵌在脂雙層表面，或嵌在其內(nèi)部，或橫跨整個(gè)脂雙層，表現(xiàn)出分布的不對(duì)稱性。根據(jù)在膜上的位置不同，膜蛋白可分為兩類：通過強(qiáng)疏水或親水作用同膜脂牢固結(jié)合不易分開的，稱為整合蛋白(integralprotein)或內(nèi)在蛋白；附著在膜表層，與膜結(jié)合比較疏松容易分離的，稱為外周蛋白(peripheralprotein)。細(xì)胞膜的表面還有糖類分子，形成糖脂、糖蛋白。因脂雙層具有流動(dòng)性，故蛋白質(zhì)分子也可以在脂雙層中橫向移動(dòng)；又因膜的內(nèi)外表面上脂類和蛋白質(zhì)的分布不均勻，反映了膜兩側(cè)的功能不同。

細(xì)胞膜是細(xì)胞與周圍環(huán)境和細(xì)胞與細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要通道。其最重要的特性是半透性，或稱選擇透過性，對(duì)進(jìn)出入細(xì)胞的物質(zhì)有很強(qiáng)的選擇透過性。這是細(xì)胞膜最基本的一種功能，如果喪失了這種功能，細(xì)胞就會(huì)死亡。細(xì)胞膜的功能有：

1)分隔形成細(xì)胞和細(xì)胞器，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，膜的面積大大

增加，提高了發(fā)生在膜上的生物功能；

2)屏障作用，膜兩側(cè)的水溶性物質(zhì)不能自由通過；3)選擇性物質(zhì)運(yùn)輸，伴隨著能量的傳遞；

4)生物功能：激素作用、酶促反應(yīng)、細(xì)胞識(shí)別、電子傳遞等；5)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能：細(xì)胞與周圍環(huán)境之間的物質(zhì)交換，是通過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)功能實(shí)現(xiàn)的，其主要轉(zhuǎn)運(yùn)方式有四種，即單純擴(kuò)散、易化擴(kuò)散、主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、入胞和出胞作用。6)細(xì)胞膜的受體功能：受體是細(xì)胞識(shí)別和結(jié)合化學(xué)信息的特殊結(jié)構(gòu)，其本質(zhì)是蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)八細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握細(xì)胞融合原理、應(yīng)用PEG融合細(xì)胞的方法以及細(xì)胞融合率的計(jì)算。實(shí)驗(yàn)用品

1.材料雞紅細(xì)胞

2.器材和儀器普通光學(xué)顯微鏡、普通低速離心機(jī)、恒溫水浴箱、刻度離心管、試管、載玻片、蓋玻片

3.試劑50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)、生理鹽水實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

一、原理

細(xì)胞融合(Cellfusion)，即在自然條件下或用人工方法(生物的、物理的、化學(xué)的)使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的過程。人工誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，在六十年代作為一門新興技術(shù)而發(fā)展起來。由于它不僅能產(chǎn)生同種細(xì)胞融合，也能產(chǎn)生種間細(xì)胞的融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

細(xì)胞融合的誘導(dǎo)物種類很多．常用的主要有滅活的仙臺(tái)病毒(Sendaivirus)，聚乙二醇

(Polyethyleneglycol，PEG)和電脈沖。目前應(yīng)用最廣泛的是聚乙二醇，因?yàn)樗�易得、�?jiǎn)便，且融合效果穩(wěn)定。PEG的促融機(jī)制尚不完全清楚，它可能引起細(xì)胞膜中磷脂的酰鍵及極性基團(tuán)發(fā)生結(jié)構(gòu)重排。二、方法

1.取新鮮雞血以0.85％生理鹽水制成10％的懸液。2.稱取0.5克PEG(MW=4,000)放入試管內(nèi)，在酒精燈上融化之，迅速加入0.5ml預(yù)熱的37℃Hanks液混勻制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中備用。

3.取上述10％的雞紅細(xì)胞懸液1ml放入離心管中，沿離心管壁滴加50％PEG溶液，邊加邊晃動(dòng)試管使之混勻，37℃水浴20min。

4.取出離心管，緩慢滴加9mlHanks液以終止PEG的作用，800g離心3min，棄上清。5.用貼壁的液體重懸細(xì)胞，取一滴制成滴片，加蓋片鏡檢。結(jié)果：在高倍鏡下可以看到有兩個(gè)或兩個(gè)以上的雞紅細(xì)胞膜融合在一起，形成一個(gè)異核體細(xì)胞。要注意辨別融合細(xì)胞與重疊的雞紅細(xì)胞。三、融合率的計(jì)算

在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞(包括融合的與未融合的細(xì)胞)，以融合細(xì)胞(含兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞核的細(xì)胞)的細(xì)胞核數(shù)除以總細(xì)胞核數(shù)(包括融合與未融合的細(xì)胞核)即得出融合率。公式如下：

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