細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報告5

湖南科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)報告

學(xué)生姓名李詩學(xué)號201*07004215專業(yè)生物技術(shù)年級、班級1102

課程名稱細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師蔣瓊鳳、沈玉平

細(xì)胞中過氧化物酶的顯示細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測與觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1.掌握顯示細(xì)胞中過氧化物酶反應(yīng)的原理和方法。2.了解細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義

3.掌握凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)檢測方法二、實(shí)驗(yàn)原理：

1.細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶能把許多胺類氧化為有色化合物，用聯(lián)苯胺處理標(biāo)本，細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色的聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變?yōu)樽厣�產(chǎn)物，因而可以根據(jù)顏色反應(yīng)來判定過氧化物酶的有無或多少。中間產(chǎn)物藍(lán)色聯(lián)苯胺是不穩(wěn)定的，無需酶的參加即可氧化為棕色化合物。

2．細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程。它是一個主動的、高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。

3.凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征是:體積變小,細(xì)胞質(zhì)濃縮;細(xì)胞核發(fā)生染色質(zhì)凝聚和聚集于核膜周圍(邊緣化);細(xì)胞膜有小泡狀形成;晚期細(xì)胞膜內(nèi)陷形成大小不同的凋亡小體;根據(jù)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行顯微觀察是檢測細(xì)胞凋亡的一種直觀、可靠的方法。三、實(shí)驗(yàn)步驟：

細(xì)胞中過氧化物酶的顯示

1、在載片上滴一滴PBS緩沖液；

2、取骨髓細(xì)胞：用斷頸法處死小鼠，立即剪取后肢，去除肌肉，剝出后肢股骨，剪開股骨一端，用牙簽尖的一端插入剪開的小孔中，摳取少許骨髓細(xì)胞置滴有PBS的載片上；

3、涂片：用另一玻片將骨髓細(xì)胞沿一個方向涂布推開，室溫晾干；

4、媒染：在涂片上滴0.5％硫酸銅液，以蓋滿涂片為宜，處理30秒-1分鐘。5、傾去硫酸銅液，直接滴入聯(lián)苯胺混合液反應(yīng)6分鐘（以蓋滿涂片為宜）6、清水沖洗，番紅復(fù)染2min。

7、鏡檢：清水沖洗，室溫晾干，先低倍鏡下觀察，后換高倍鏡下觀察（油鏡100×）

細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測與觀察吉姆薩染色:

1、取細(xì)胞爬片置于小培養(yǎng)皿中(有細(xì)胞面朝上)2、生理鹽水輕輕漂洗細(xì)胞3、95%乙醇固定5min

4、PBS緩沖液洗2次

5、吉姆薩染色液染色5min6、蒸餾水輕輕洗去染液

7、普通光學(xué)顯微鏡下觀察。吖啶橙染色:

1、取細(xì)胞爬片置于小培養(yǎng)皿中(有細(xì)胞面朝上)2、生理鹽水輕輕漂洗細(xì)胞

3、甲醇：冰醋酸（3：1）固定5min4、PBS緩沖液洗2次每次1min

5、0.01%吖啶橙染色液在避光環(huán)境下染色5min6、蒸餾水輕輕洗去染液

6、選用藍(lán)光激發(fā)濾片在熒光顯微鏡下觀察。四、結(jié)果與分析：

1、根據(jù)隨機(jī)選擇的幾個視野的統(tǒng)計，該樣品的細(xì)胞凋亡率=227/506×100=44.9

Hela細(xì)胞凋亡過程中核染色質(zhì)的形態(tài)變化（吖啶橙染色）

五、思考題：

1、細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制

細(xì)胞凋亡是一個受基因調(diào)控、眾多細(xì)胞膜受體和胞漿蛋白參與的細(xì)胞主動自殺過程，其觸發(fā)因素多種多樣，包括細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)因子和抑制因子對細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

2、細(xì)胞凋亡的特征

凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征是:體積變小,細(xì)胞質(zhì)濃縮;細(xì)胞核發(fā)生染色質(zhì)凝聚和聚集于核膜周圍(邊緣化);細(xì)胞膜有小泡狀形成;晚期細(xì)胞膜內(nèi)陷形成大小不同的凋亡小體。

3、研究細(xì)胞凋亡的方法

定性的研究方法：常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳、脈沖場倒轉(zhuǎn)瓊脂糖凝膠電泳、形態(tài)學(xué)觀察（普通光學(xué)顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）

定量或半定量的研究方法：各種流式細(xì)胞儀方法、原位末端標(biāo)記法、ELISA定量瓊脂糖凝膠電泳。

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