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關(guān)于細(xì)菌超聲破碎的一些經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

網(wǎng)站:公文素材庫(kù) | 時(shí)間:2019-05-29 12:39:37 | 移動(dòng)端:關(guān)于細(xì)菌超聲破碎的一些經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

關(guān)于細(xì)菌超聲破碎的一些經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

細(xì)菌工程菌胞內(nèi)表達(dá)主要分為兩種形式,一種是在強(qiáng)啟動(dòng)子條件下的高效表達(dá),由于蛋白的過(guò)度表達(dá),使蛋白不能及時(shí)有效折疊而發(fā)生無(wú)規(guī)則卷曲,以固體顆粒的形式堆積于胞間質(zhì)中,這就是所說(shuō)的包涵體,另外一種是間質(zhì)內(nèi)的可溶性表達(dá),即可以發(fā)生正常折疊,具有生物活性。一般情況下,細(xì)菌只要被正常破壁就可以通過(guò)離心的形式將包涵體和可溶性表達(dá)的蛋白分離開(kāi)。

超聲破碎的條件一般是300w,10s/10s,20分鐘,具體條件可根據(jù)自身情況而定。

超聲前菌體的準(zhǔn)備:菌液離心后,先用PBS將菌沉淀洗2-3遍,然后按原菌液體積的1/5-1/10加入裂解液重懸菌體,裂解液的成分:50mMTris-HCl,pH8.0,2mMEDTA,100mMNaCl,加溶菌酶至100ug/ml,0.1%TritonX-100。切記冰浴超聲!

如何判斷是否超聲完全:根據(jù)網(wǎng)友的經(jīng)驗(yàn),一般有以下幾個(gè)方面:1,外觀判斷:超聲前菌懸液是渾濁的,超聲完全后變的透明、清澈。2,液體的粘滯性:超聲后菌液從槍頭滴下不粘連。

3,高速離心:有用高速離心檢測(cè)超聲破碎程度的(一般用6,000g10min,比一般離心收集菌體的轉(zhuǎn)速高一點(diǎn))。沉淀是未破碎或破碎不完全的菌體。4,染色:破碎后的菌液涂片,革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘,鏡檢。超聲后加入核酸酶消除核酸對(duì)蛋白的污染。一些需要注意的問(wèn)題:

1,蛋白以包涵體形式表達(dá),追求的是高破碎率,要求細(xì)胞碎片很小,而另一種蛋白是可溶形式表達(dá),所以細(xì)胞碎片不能很小,兩種情況要求不同但目的相同,都是便于后期的固液分離。2,如果超聲時(shí)出現(xiàn)黑色沉淀,說(shuō)明超聲功率太強(qiáng)。3,超聲時(shí)間太長(zhǎng)、功率太高對(duì)蛋白活性肯定有影響。4,盡量防止泡沫的產(chǎn)生。

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細(xì)菌工程菌胞內(nèi)表達(dá)主要分為兩種形式,一種是在強(qiáng)啟動(dòng)子條件下的高效表達(dá),由于蛋白的過(guò)度表達(dá),使蛋白不能及時(shí)有效折疊而發(fā)生無(wú)規(guī)則卷曲,以固體顆粒的形式堆積于胞間質(zhì)中,這就是所說(shuō)的包涵體,另外一種是間質(zhì)內(nèi)的可溶性表達(dá),即可以發(fā)生正常折疊,具有生物活性。一般情況下,細(xì)菌只要被正常破壁就可以通過(guò)離心的形式將包涵體和可溶性表達(dá)的蛋白分離開(kāi)。

超聲破碎的條件一般是300w,10s/10s,20分鐘,具體條件可根據(jù)自身情況而定。

超聲前菌體的準(zhǔn)備:菌液離心后,先用PBS將菌沉淀洗2-3遍,然后按原菌液體積的1/5-1/10加入裂解液重懸菌體,裂解液的成分:50mMTris-HCl,pH8.0,2mMEDTA,100mMNaCl,加溶菌酶至100ug/ml,0.1%TritonX-100。切記冰浴超聲!

如何判斷是否超聲完全:根據(jù)網(wǎng)友的經(jīng)驗(yàn),一般有以下幾個(gè)方面:1,外觀判斷:超聲前菌懸液是渾濁的,超聲完全后變的透明、清澈。2,液體的粘滯性:超聲后菌液從槍頭滴下不粘連。

3,高速離心:有用高速離心檢測(cè)超聲破碎程度的(一般用6,000g10min,比一般離心收集菌體的轉(zhuǎn)速高一點(diǎn))。沉淀是未破碎或破碎不完全的菌體。

4,染色:破碎后的菌液涂片,革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘,鏡檢。超聲后加入核酸酶消除核酸對(duì)蛋白的污染。一些需要注意的問(wèn)題:

1,蛋白以包涵體形式表達(dá),追求的是高破碎率,要求細(xì)胞碎片很小,而另一種蛋白是可溶形式表達(dá),所以細(xì)胞碎片不能很小,兩種情況要求不同但目的相同,都是便于后期的固液分離。2,如果超聲時(shí)出現(xiàn)黑色沉淀,說(shuō)明超聲功率太強(qiáng)。3,超聲時(shí)間太長(zhǎng)、功率太高對(duì)蛋白活性肯定有影響。4,盡量防止泡沫的產(chǎn)生。

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