臨床藥師微生物室見(jiàn)習(xí)小結(jié)

臨床藥師微生物室見(jiàn)習(xí)小結(jié)

微生物室是我此次臨床藥師進(jìn)修的第一站，也是非常重要的第一步，經(jīng)過(guò)這一個(gè)月的學(xué)習(xí)，我對(duì)于一張張藥物敏感性報(bào)告后的各個(gè)步驟有了更直觀的認(rèn)識(shí)，學(xué)習(xí)從臨床檢驗(yàn)的角度看待抗生素的合理使用，

在這一個(gè)月的學(xué)習(xí)中，我了解了微生物室常用的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法，熟悉抗菌藥物敏感試驗(yàn)方法和特殊耐藥機(jī)制的篩選方法，并跟隨帶教老師參與了簡(jiǎn)單的臨床檢驗(yàn)操作及藥敏報(bào)告的解讀。同時(shí)，熟悉了微生物的基本分類，本地區(qū)常見(jiàn)的病原菌及耐藥情況，以及臨床常見(jiàn)感染性疾病的常見(jiàn)病原菌及耐藥情況。在老師的耐心教導(dǎo)下，我對(duì)于MRSA、、VRE、PRSP、產(chǎn)ESBLs菌等幾種特殊病原菌的耐藥情況及藥物選擇有了更加全面系統(tǒng)的學(xué)習(xí)。這一個(gè)月的學(xué)習(xí)讓我受益匪淺。

擴(kuò)展閱讀：微生物實(shí)習(xí)總結(jié)

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

201*《微生物學(xué)》教學(xué)實(shí)習(xí)總結(jié)

專業(yè)：課程名稱：實(shí)習(xí)時(shí)間：學(xué)號(hào):植物保護(hù)（微生物工程方向）指導(dǎo)老師：紀(jì)春艷，阮小蕾，卓侃微生物教學(xué)實(shí)習(xí)201*.04.23-04.27（第十周）201*30201*19學(xué)生姓名王艷麗班級(jí)：09植保微生物2班一、實(shí)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（一）土壤微生物的分離、培養(yǎng)及識(shí)別

1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容

目的：1）掌握從土壤中分離微生物的方法

2）掌握常用的分離純化微生物的操作技術(shù)內(nèi)容：1）用稀釋法分離細(xì)菌、放線菌和霉菌2）用平板劃線方法分離微生物3）斜面接種及穿刺接種

2.實(shí)驗(yàn)原理

①?gòu)幕祀s的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物的分離與純化，方法有：?jiǎn)渭?xì)胞挑取法、平板劃線法和稀釋倒平板法。本實(shí)驗(yàn)利用稀釋倒平板從土壤中分離細(xì)菌、放線菌和霉菌�；�本原理為：將含有各種微生物的土壤懸浮液進(jìn)行稀釋后涂布接種到各種選擇培養(yǎng)基平板上，在不同條件下培養(yǎng)，從而使各種微生物在各自的培養(yǎng)基上形成單菌落。單菌落是一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體，即是一個(gè)純培養(yǎng)。

②平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散為單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到不同選擇性培養(yǎng)基的平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

3.實(shí)驗(yàn)材料

1)培養(yǎng)基已滅菌的牛肉膏、高氏一號(hào)、查氏培養(yǎng)基。2)儀器及用具99mL無(wú)菌水1瓶，含9mL無(wú)菌水的試管6支，80%乳酸，95%乙醇，無(wú)菌培養(yǎng)皿，1mL無(wú)菌移液管，土壤樣品、天平、稱量紙、鑰匙、試管架、涂布器。4.操作步驟

（一）土壤稀釋分離法分離純化細(xì)菌、放線菌和霉菌1.土壤樣品采集

待測(cè)地塊上，若地塊面積小于50平方米，對(duì)角線三點(diǎn)采樣，若大于50平方米，對(duì)角線五點(diǎn)采樣。一般定點(diǎn)于耕作層0--20cm，先除去表土1--2cm，以無(wú)菌鏟采土足量充分混勻后用無(wú)菌塑料袋分裝。

2.無(wú)菌操作制備土壤稀釋液

1)制備土壤懸液：稱取土樣1g，迅速倒入含有99mL無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩5~10min，使土樣充分打散，即成10-2的土壤懸液。

2)稀釋：用無(wú)菌移液管吸10-2的土壤懸液1mL，吹入9mL無(wú)菌水即成10-3稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成10-3~10-8的稀釋液。注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換用一支移液管，每次吸入土液后，要將移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。3.涂布法測(cè)定菌落數(shù)的方法

1)涂布法：將0.1~0.2mL菌懸液滴在平板表面中央位置，右手拿無(wú)菌涂布器平放于平板表面，將菌液先沿一條直線輕輕來(lái)回推動(dòng)，使之均勻分布，然后改變方向沿另一垂直線來(lái)回推動(dòng)，平板邊緣可改變方向用涂布器再涂布幾次。

2)接種量和培養(yǎng)基：細(xì)菌：取10-6、10-7、10-8兩管稀釋液各0.2mL，分別接入兩個(gè)牛肉膏蛋白胨瓊脂平板中，涂布均勻。放線菌：取10-2、10-3、10-4兩管稀釋液，在每管中加入10%酚液5~6滴，搖勻，靜置片刻，然后分別從兩管中吸出0.2mL加入高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板中，涂布均勻。霉菌：取10-2、10-3、10-4兩管稀釋液各0.2mL，分別接入查氏培養(yǎng)基中，涂布搖勻。

4.培養(yǎng)將接種好的細(xì)菌、放線菌、霉菌平板倒置，即皿蓋朝下放置，于28~30℃中恒溫培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)1~2d，放線菌培養(yǎng)5~7d，霉菌培養(yǎng)3~5d。觀察生長(zhǎng)的菌落，用于進(jìn)一步純化分離或直接轉(zhuǎn)接斜面。

5.劃線分離細(xì)菌用接種環(huán)從待純化的菌落或待分離的斜面菌種只沾取少量菌樣，在相應(yīng)培養(yǎng)基平板中劃線分離。劃線的方法多樣，目的是獲得單個(gè)菌落。常用的劃線方法有兩種：連續(xù)劃線和分區(qū)劃線。

6.穿刺接種霉菌用接種針將培養(yǎng)出的霉菌挑出，接種到新的查氏培養(yǎng)基上。5.注意事項(xiàng)

1)一般土壤中，細(xì)菌最多，放線菌及霉菌次之，而酵母菌主要見(jiàn)于果園及菜園土壤中。故從土壤中分離細(xì)菌時(shí)，要取較高的稀釋度，否則菌落連成一片不能計(jì)數(shù)。

2)在土壤稀釋分離操作中，每稀釋10倍，最好更換一次移液管，使計(jì)數(shù)準(zhǔn)確。3)放線菌的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，故制平板的培養(yǎng)基用量可適當(dāng)增多。6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

①本小組任務(wù)是用涂布法分離土壤中的真菌，選用的是查氏培養(yǎng)基，因細(xì)菌長(zhǎng)勢(shì)比真菌快，且培養(yǎng)基中未加鏈霉素、抗生素等抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，因此本次實(shí)驗(yàn)用于分離的9個(gè)培養(yǎng)皿全部長(zhǎng)出了細(xì)菌，只有處理濃度為10-4土壤懸液中的一個(gè)皿中長(zhǎng)出了少量真菌（即霉菌）菌落。②劃線法分離細(xì)菌：其中一個(gè)皿劃線重復(fù)，未達(dá)到劃線稀釋的目的，最后沒(méi)有長(zhǎng)出單菌落，另一個(gè)皿雖劃線無(wú)重復(fù)，但是劃線次數(shù)較少，也沒(méi)有分離出單菌落。

③霉菌分離：接種的地方有霉菌菌落長(zhǎng)出，但其他地方也有霉菌菌落，分離結(jié)果不好。（二）水的細(xì)菌學(xué)檢查細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定1．目的要求

通過(guò)實(shí)驗(yàn)掌握水樣的采集和水樣中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定方法。2.實(shí)驗(yàn)原理1)水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定

水中的細(xì)菌總數(shù)越多，說(shuō)明水中有機(jī)物的含量就越高，水體被有機(jī)物污染的程度越重。水中細(xì)菌的種屬繁多，以一定的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)出來(lái)的菌落，計(jì)算出來(lái)的水中的細(xì)菌的總數(shù)實(shí)際上是一種近似值。

絕大多數(shù)腐生性和致病性的細(xì)菌，可在肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進(jìn)行生長(zhǎng)。因此應(yīng)用平板菌落計(jì)數(shù)技術(shù)來(lái)測(cè)定水樣中的細(xì)菌總數(shù)基本上能代表水樣中細(xì)菌的數(shù)量。

2)水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定和計(jì)算

在肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，1ml水樣，經(jīng)37℃，24h培養(yǎng)后所生長(zhǎng)出來(lái)的總菌數(shù)。我國(guó)飲用水的衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)：在1ml自來(lái)水中細(xì)菌總數(shù)不得超過(guò)100個(gè)。

3.實(shí)驗(yàn)器材

培養(yǎng)基：肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；滅菌水

其他用具：滅菌三角瓶，滅菌培養(yǎng)皿，滅菌試管等4.操作步驟

1)水樣的采集

自來(lái)水：水龍頭火焰灼燒3min，再開(kāi)放水龍頭流水5min后，以滅菌三角瓶接取水樣。湖水：取距水面10-15cm的深層水樣，最好立即實(shí)驗(yàn)，否則放入冰箱中保存。

2)細(xì)菌總數(shù)測(cè)定（1）自來(lái)水

A、用滅菌管吸取1ml水樣，注入滅菌培養(yǎng)皿中，做兩個(gè)皿。

B、分別傾入約15ml已溶化并冷卻到45℃左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，在桌上作平面旋搖，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。

C、另取一空的滅菌培養(yǎng)皿，傾入約15ml肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，作空白對(duì)照。D、培養(yǎng)基凝固后，倒置于37℃中，培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。（2）湖水A、稀釋水樣：

a、取4個(gè)滅菌空試管，分別加入9ml滅菌水。b、取1ml水樣注入第一管9ml滅菌水內(nèi)、搖勻。

c、再自第一管取1ml至下一管滅菌水內(nèi)，如此稀釋到第四管，稀釋度分別為10-1、10-2、10-3、10-4。

B、自最后三個(gè)稀釋度的試管中各取1ml稀釋水加入空的滅菌培養(yǎng)皿中，每一稀釋度做兩個(gè)培養(yǎng)皿。

C、各傾入約15ml已溶化并冷卻到45℃左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，在桌上作平面旋搖，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。D、培養(yǎng)基凝固后，倒置于37℃中，培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

3)菌落計(jì)數(shù)

1、自來(lái)水：兩個(gè)平板的平均菌落數(shù)即為1ml水樣的細(xì)菌總數(shù)。2、湖水：

（1）先計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù)。若其中一個(gè)平板有較大片狀菌苔生長(zhǎng)時(shí)，則不應(yīng)采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌苔生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌苔的大小不到平板的1/2，而其余的一半菌落分布又很均勻時(shí)，則可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全平板的菌落數(shù)。

（2）首先選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該水樣的細(xì)菌總數(shù)。

（3）若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均在30-300之間，則按兩者菌落總數(shù)之比值來(lái)決定。若其比值小于2，采取兩者的平均值，若大于2，則取其中較小的菌落總數(shù)。

（4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。

（5）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。

（6）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，則以最近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。

5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

⑴自來(lái)水：對(duì)照平板菌落為：0。自來(lái)水樣兩平板的菌落數(shù)分別為：3、1。所以1ml水樣的細(xì)菌總數(shù)為2個(gè)/ml。

⑵湖水

湖水樣不同稀釋度的平均菌落數(shù)10-2湖水1湖水2平均877.510-3433.510-4396.0由于所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，所以按照稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。湖水中的細(xì)菌總數(shù)為7.5×102個(gè)/ml。

6.思考題

1、從自來(lái)水水樣細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)的結(jié)果判斷是否符合飲用水的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)？

答：由于我國(guó)飲用水的衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)為：在1ml自來(lái)水中細(xì)菌總數(shù)不得超過(guò)100，而小組測(cè)定的自來(lái)水中細(xì)菌數(shù)為2個(gè)/ml。所以從自來(lái)水水樣細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)的結(jié)果看，符合飲用水的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

2、你所測(cè)的池塘水、河水、湖水的污穢度如何？通過(guò)實(shí)驗(yàn)?zāi)銓?duì)保護(hù)水資源有何認(rèn)識(shí)？答：我組所測(cè)的湖水污穢度較高，可能存在誤差。通過(guò)實(shí)驗(yàn)使我們明白只有保護(hù)水源，保證其清潔，才能保證我們?nèi)祟愖陨淼睦�益，無(wú)論是飲食方面，還是環(huán)境方面。

3、試與其他同學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，從中判斷你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差如何？原因是什么？答：與其他同學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較，我組自來(lái)水水樣細(xì)菌總數(shù)與他組相差不大，但湖水細(xì)菌總數(shù)少一些，可能原因是用傾注法倒入培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)基未冷卻至45℃一下，所以高溫殺死了大量細(xì)菌。

4、請(qǐng)回答：干熱滅菌、高壓濕熱滅菌、過(guò)濾除菌的原理及適用范圍。

答：1干熱滅菌：通過(guò)燒灼或烘烤等方法，使微生物酶、蛋白質(zhì)變性而殺死微生物。干熱滅菌包括：

①烘箱熱空氣法：適用于金屬和玻璃器皿的滅菌，也是唯一可用于油料和粉料物質(zhì)的滅菌方法。

②火焰焚燒法：常使用酒精燈火焰焚燒接種環(huán)、接種針和試管口等經(jīng)焚燒不會(huì)損壞的物品。2高壓濕熱滅菌：熱蒸汽對(duì)細(xì)胞成分的破壞作用更強(qiáng)，水分子的存在有助于破壞維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的氫鍵和其他相互作用弱鍵，更易使蛋白質(zhì)變形，還可以使細(xì)胞膜脂溶解。高壓真氣還可以破壞核酸結(jié)構(gòu)，殺滅那些蛋白質(zhì)外殼變性后仍具有侵染性的病毒。熱蒸汽比空氣穿透力強(qiáng)，能更加有效地殺滅微生物。蒸汽存在潛熱，當(dāng)氣體轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w時(shí)可放出大量熱量，顧可迅速提高滅菌物體的溫度。

①水煮沸法：適用于注射器、解剖用具及家庭餐具的消毒。

②高壓蒸汽鍋法：主要用于各種耐熱耐濕物品的物品，如一般培養(yǎng)基、生理鹽水等各種溶液、工作服及實(shí)驗(yàn)器材等。

3過(guò)濾除菌：將液體通過(guò)某種多孔的材料，使微生物與液體分離。可用于對(duì)熱敏感液體的滅菌，如含有酶或維生素的溶液、血清等。還可用于啤酒生產(chǎn)代替巴斯德消毒。

二、實(shí)習(xí)學(xué)習(xí)參觀益力多公司參觀及珠江啤酒集團(tuán)參觀

（一）益力多乳制品制作流程及工藝

原料溶解罐（用熱水將奶粉及糖類溶解成液狀奶）→殺菌機(jī)（殺菌后得到清潔的原料汁）→種菌罐（存儲(chǔ)益力多菌）→培養(yǎng)罐（用益力多菌發(fā)酵，制造發(fā)酵液）→糖漿罐（制造糖漿）→調(diào)和液儲(chǔ)存罐（將糖漿加到發(fā)酵液中制得原料液）→混合機(jī)（將原料液和原料水混合調(diào)配成益力多的味道）→成形機(jī)（制造益力多容器）→灌裝機(jī)（灌裝益力多液）→封蓋機(jī)（封蓋）→收縮包裝機(jī)（5支及50支包裝成形）

（二）微生物與益力多乳制品制作（微生物原理）

乳制品生產(chǎn)過(guò)程中利用的微生物是乳酸菌。益力多乳制品主要與干酪乳桿菌代田株（即益力多菌）密切相關(guān)，它利用人們提供的底物原料，在適宜的條件下大量生長(zhǎng)、繁殖，是一種益生菌。益力多乳制品提供的是一種活菌，而不是益力多菌的代謝產(chǎn)物，據(jù)說(shuō)，在一瓶益力多飲品中就有100億個(gè)活性細(xì)菌。益力多菌符合益生菌的7個(gè)條件，即：1.能夠耐受胃液、膽汁、以存活的狀態(tài)到達(dá)腸內(nèi)；2.能夠在腸內(nèi)增殖；3.被科學(xué)實(shí)驗(yàn)證明能夠改善腸內(nèi)菌群；4.能夠確保安全性；5.原來(lái)就是人體腸道菌群的一種；6.存活在食品中并能保持有效的菌數(shù)；7.價(jià)廉且容易處理。產(chǎn)品一般可以改善微生物與酶的平衡或刺激特異性與非特特異性免疫，從而改善腸道菌群構(gòu)成。飲用益力多菌可抑制腸內(nèi)有害菌的增殖，有害菌所產(chǎn)生的各種有害物質(zhì)則相應(yīng)減少。此外，益力多菌產(chǎn)生的乳酸及乙酸能刺激腸道運(yùn)行而改善排便。有研究表明，益力多菌能使體內(nèi)NK細(xì)胞活性化，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，從而提高人體自身對(duì)細(xì)胞的功擊和病原體感染的防御能力。

（三）珠江啤酒釀造流程及工藝

麥芽倉(cāng)（儲(chǔ)存麥芽）→粉碎機(jī)（粉碎麥芽）→糖化鍋（粉碎后的麥芽和一定量的釀造水混合，麥芽中的蛋白質(zhì)分解成多肽和氨基酸，淀粉分解成麥芽糖、葡萄糖等糖類物質(zhì)的過(guò)程）→大米篩選機(jī)→大米粉碎機(jī)（原料與處理）→糊化鍋（大米糊化）→麥芽過(guò)濾槽（過(guò)濾糊化雜質(zhì)）→煮沸鍋（過(guò)濾后的麥汁加入酒花、麥汁澄清劑等輔料，完成煮沸過(guò)程，目的是使麥汁達(dá)到一定濃度，殺死麥汁中全部的酶和致病菌及麥汁中的蛋白質(zhì)絮凝等）→酒花濾除器→回旋沉淀槽（去除麥汁中的熱凝固物，使煮沸后的麥汁清亮透明）→麥汁冷卻器（利用4℃冰水，經(jīng)過(guò)薄板換熱器將麥汁冷卻到工藝規(guī)定的溫度）→空氣過(guò)濾器→酵母培養(yǎng)及添加罐（培養(yǎng)酵母）→發(fā)酵罐（酵母利用麥汁中碳源和氮源兩大能源物質(zhì)，經(jīng)過(guò)有氧呼吸和無(wú)氧發(fā)酵，將麥汁中的可發(fā)酵性糖分解成酒精、二氧化碳和其他一系列發(fā)酵副產(chǎn)物的過(guò)程）→啤酒添加劑添加罐→緩沖罐硅藻土添加罐→硅藻土過(guò)濾罐→硅藻土過(guò)濾機(jī)（利用硅藻土對(duì)啤酒后期處理）→冷儲(chǔ)藏→過(guò)濾器→儲(chǔ)酒罐→灌裝→出場(chǎng)

（四）微生物與珠江啤酒釀造（微生物原理）

用于啤酒釀造的微生物為酵母菌，啤酒的生產(chǎn)是依靠純種啤酒酵母利用麥芽汁中的糖，氨基酸等可發(fā)酵性物質(zhì)通過(guò)一系列的生物化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生乙醇,二氧化碳及其他代謝副產(chǎn)物，從而得到具有獨(dú)特風(fēng)味的低度飲料酒。啤酒發(fā)酵過(guò)程中主要涉及糖類和含氮物質(zhì)的轉(zhuǎn)化以及啤酒風(fēng)味物質(zhì)的形成等有關(guān)基本理論。

冷麥汁接種啤酒酵母后，發(fā)酵即開(kāi)始進(jìn)行。啤酒發(fā)酵是在啤酒酵母體內(nèi)所含的一系列酶類的作用下，以麥汁所含的可發(fā)酵性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為底物而進(jìn)行的一系列生物化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)新陳代謝最終得到一定量的酵母菌體和乙醇，CO2以及少量的代謝副產(chǎn)物如高級(jí)醇、酯類、連二酮類、醛類、酸類和含硫化合物等發(fā)酵產(chǎn)物，這些發(fā)酵產(chǎn)物影響到啤酒的風(fēng)味、泡沫性能、色澤、非生物穩(wěn)定性等理化指標(biāo)，并形成了啤酒的典型性。啤酒發(fā)酵分主發(fā)酵(旺盛發(fā)酵)和后熟兩個(gè)階段。在主發(fā)酵階段，進(jìn)行酵母的適當(dāng)繁殖和大部分可發(fā)酵性糖的分解，同時(shí)形成主要的代謝產(chǎn)物乙醇和高級(jí)醇、醛類、雙乙酰及其前驅(qū)物質(zhì)等代謝副產(chǎn)物；后熟階段主要進(jìn)行雙乙酰的還原使酒成熟，完成殘?zhí)堑睦^續(xù)發(fā)酵和CO2的飽和，使啤酒口味清爽，并促進(jìn)了啤酒的澄清。

（五）益力多公司參觀及珠江啤酒集團(tuán)參觀感受

參觀完益力多公司及珠江啤酒集團(tuán)，深刻體會(huì)到微生物與我們的生活息息相關(guān)，微生物雖不起眼，卻對(duì)人類的生活有巨大的影響，加深了我對(duì)微生物學(xué)的興趣，同時(shí)對(duì)益力多公司及珠江啤酒集團(tuán)一系列自動(dòng)化設(shè)備表示贊嘆。通過(guò)參觀，了解了實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中微生物發(fā)酵工藝、流程、原理，理論與實(shí)際相結(jié)合，增進(jìn)了對(duì)課本知識(shí)的理解。

三、實(shí)習(xí)小論文

啤酒制作過(guò)程中有害微生物的污染及控制

[摘要]本文主要講述啤酒制作過(guò)程中有害微生物的類群、危害、鑒定及控制方法。

1.啤酒有害微生物

啤酒生產(chǎn)中，有害微生物主要來(lái)源于壓縮空氣、水源、原料與輔料、接種酵母、設(shè)備與管路、包裝材料以及各種用具、操作人員及周圍環(huán)境等，種子酵母的污染和制作過(guò)程中的無(wú)菌程度尤其重要。有害微生物的生長(zhǎng)繁殖會(huì)嚴(yán)重影響啤酒的風(fēng)味、色澤、質(zhì)量，因此能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出啤酒制作過(guò)程中的有害微生物并加以控制，是提高啤酒品質(zhì)的重要因素之一。

2.啤酒有害微生物的類群

2.1按照污染細(xì)菌對(duì)啤酒生產(chǎn)的危害程度，可將啤酒釀造中常見(jiàn)的污染細(xì)菌分為啤酒有害微生物、啤酒間接有害微生物、啤酒潛在有害微生物。（1）啤酒有害微生物：此類菌在各種啤酒中能生長(zhǎng)產(chǎn)生危害，并能通過(guò)多種途徑傳播，主要是革蘭氏陽(yáng)性的乳酸菌類、革蘭氏陰性的果膠桿菌、巨球菌及野生酵母。

（2）啤酒間接有害微生物：此類微生物具有腐敗性質(zhì)，但它們不能在正常的啤酒中生長(zhǎng)，故可看作對(duì)啤酒無(wú)直接害處，例如芽抱桿菌對(duì)酒花物質(zhì)非常敏感，以致不能在啤酒中生長(zhǎng)，但它們能形成耐熱的孢子，遺留在啤酒中。霉菌是需氧菌也不能在啤酒中生長(zhǎng)，但能在原料、容器、包裝材料上生長(zhǎng)成菌落，產(chǎn)生霉昧，間接傳到啤酒中，影響啤酒質(zhì)量。

（3）啤酒潛在有害微生物：此類菌是在一定條件下危害啤酒的細(xì)菌，包括鏈球菌、明串珠菌、乳鏈球菌、克氏小球菌等。當(dāng)工藝控制出現(xiàn)不正常，啤酒中控制因素降低時(shí)，潛在有害菌才生長(zhǎng)，特別是在以下情況下：PH值>4.5、氧含量>1mg/L、過(guò)低的苦味質(zhì)低于20EBC單位、過(guò)高的發(fā)酵度與最終發(fā)酵度的差別(大于1%)、糖化不好等。

2.2按照對(duì)氧氣的需求，啤酒制作過(guò)程中常見(jiàn)的有害微生物可分為：好氧微生物、微好氧微生物、兼性好氧微生物、絕對(duì)好氧微生物四大類群。以下簡(jiǎn)單介紹幾種：

（1）乳酸菌：是啤酒工廠污染的主要細(xì)菌，其中包含乳酸桿菌和足球菌兩個(gè)屬。它們廣泛存在于發(fā)酵罐、管道、閥門、啤酒殘液中。前者不耐酒花且在低溫下生長(zhǎng)緩慢，所以不污染啤酒發(fā)酵過(guò)程；后者會(huì)導(dǎo)致啤酒酸化，產(chǎn)生雙乙酰的奶油氣味，同時(shí)會(huì)分泌莢膜多糖，使啤酒粘稠、渾濁。

（2）發(fā)酵單胞菌：發(fā)酵單孢菌污染可在包裝啤酒中產(chǎn)生硫化氫和乙腔，另外，還能產(chǎn)生少量的二甲基硫和二甲基二硫。在較廣的pH范圍內(nèi)生長(zhǎng)。污染后會(huì)使啤酒變味。對(duì)酒花不敏感，耐酸耐酒精強(qiáng)。

（3）果膠桿菌：是革蘭氏陰性、過(guò)氧化氫酶陰性、嚴(yán)格厭氧菌�？稍邴溨�和包裝啤酒中產(chǎn)生大量的乙酸、丙酸和3一羥基丁酮。在被果膠桿菌污染的啤酒中還可檢出高濃度的H2S，啤酒出現(xiàn)混濁，并帶有一股臭雞蛋味。

（4）巨球菌：它是專性厭氧的、革蘭氏陰性、過(guò)氧化氫酶陰性的球菌。可在啤酒中產(chǎn)生大量的丁酸，同時(shí)產(chǎn)生少量的乙酸、異戊酸及3一羥基丁酮。麥汁受到污染后，也會(huì)產(chǎn)生大量的丁酸和乙酸及少量的戊酸和異戊酸，但不會(huì)產(chǎn)生3一羥基丁酮。會(huì)給啤酒帶來(lái)難聞的氣味。

（5）腸道細(xì)菌：發(fā)酵車間經(jīng)�？梢詸z測(cè)到如歐式桿菌屬、克式桿菌屬、多變桿菌屬等，它們存在于植物、土壤和水中。腸道細(xì)菌在大麥中繁殖迅速，能產(chǎn)生爛白菜的氣味，甚至有H2S的味道。在麥汁和發(fā)酵初期，也極易迅速繁殖，危害到啤酒的風(fēng)味。但它在pH4.0以下，2.0%乙醇啤酒中不能繁殖。

（6）變形肥大桿菌：污染后會(huì)使啤酒產(chǎn)生二甲硫味。它在pH低于3.9時(shí)不能生長(zhǎng)，但耐6.0%乙醇。

3.啤酒有害微生物的危害

（1）異味的產(chǎn)生：有害微生物的各種代謝產(chǎn)物，都能造成啤酒的異味，即使死亡或被除去，異味會(huì)依然留在啤酒中。

（2）渾濁和沉淀：有害微生物在發(fā)酵和儲(chǔ)酒中繁殖，會(huì)破壞啤酒的膠體平衡，使啤酒很難澄清，以致于過(guò)濾很困難。另外，過(guò)濾及包裝以后，經(jīng)熱消菌和殺菌，微生物的死細(xì)胞體也會(huì)影響啤酒的澄清透明。

（3）黏度升高：有害微生物分泌的多糖物質(zhì)使啤酒黏度升高，變混影響啤酒外觀，同時(shí)啤酒也喪失了爽口性。

（4）壓力提高：瓶裝和罐裝啤酒中，繁殖一些產(chǎn)氣的微生物，如野生酵母和乳酸細(xì)菌，使瓶和罐的壓力升高，增加容器爆炸的幾率，對(duì)消費(fèi)者有潛在的危險(xiǎn)。

（5）影響酵母的正常生長(zhǎng)和繁殖：冷麥汁和發(fā)酵液被雜菌污染后，雜菌會(huì)與酵母爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)，使酵母使用代數(shù)縮短、發(fā)酵性能降低。再次接種，會(huì)導(dǎo)致異常發(fā)酵，副產(chǎn)物增多，啤酒風(fēng)味敗壞等。

（6）增加消耗，生產(chǎn)效率下降

4.啤酒有害微生物的鑒定4.1傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基法

（1）A麥汁培養(yǎng)基，用于檢測(cè)細(xì)菌。利用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基并在培養(yǎng)基內(nèi)加入中性紅染色劑和放線菌酮以抑制酵母和大多數(shù)其他微生物的生長(zhǎng)。在30℃下培養(yǎng)，24h檢查菌落為紅色、平滑者，可能是腸道細(xì)菌；紅色、粘性者，可能是檸檬酸細(xì)菌；無(wú)色、微暗或黃色、平滑者，可能是哈夫尼菌。

（2）LAB和MRS乳酸菌培養(yǎng)基，用于檢測(cè)乳酸菌。利用MRS瓊脂培養(yǎng)基、SAD李氏多級(jí)選擇培養(yǎng)基及乳酸菌培養(yǎng)基分別在需氧或厭氧條件下27~30℃培養(yǎng)，3~6天即可觀察結(jié)果。（3）LYS和SDM賴氨酸和差別培養(yǎng)基，用于檢測(cè)野生酵母。將待檢測(cè)樣品處理后涂布在結(jié)晶紫培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48h，凡能生長(zhǎng)的即為酵母屬野生酵母，非酵母屬的野生酵母不會(huì)生長(zhǎng)。

（4）NBB培養(yǎng)基，它分為三種形式：NBBA適用于洗罐水、啤酒等樣品的細(xì)菌檢查；NBBB適用于酵母（回收酵母、培養(yǎng)酵母）的細(xì)菌檢查；NBBC適用于有酵母的渾濁啤酒，如發(fā)酵液、未過(guò)濾啤酒。

4.2PCR技術(shù)

（1）使用一套特異性的引物或一套由特異性引物和一個(gè)普通引物所組成的引物，此PCR技術(shù)僅產(chǎn)生一種產(chǎn)物。

（2）用任意引物，得到一群長(zhǎng)短不一的DNA片段混合物，此方法可以鑒別啤酒腐敗菌的種及其亞種。

（3）嵌套多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)，其機(jī)理在于操作中需要兩套引物。5.啤酒有害微生物的控制5.1來(lái)源控制

（1）水原水在使用前必須進(jìn)行膜過(guò)濾、紫外線殺菌和熱脫氧等必要的處理。關(guān)鍵程序中應(yīng)當(dāng)使用無(wú)菌水，此外，生產(chǎn)中應(yīng)盡量使用新鮮水，同時(shí)避免蓄水時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，要對(duì)輸水管道、蓄水池或過(guò)濾裝置等進(jìn)行定期清洗和殺菌。

（2）氣體啤酒生產(chǎn)中常用的氣體主要有氮?dú)�、CO2、壓縮空氣，而氣體中的微塵或水分子是微生物傳播的載體。這些氣體常用于充氧、備壓、引酒和充填、洗滌等，會(huì)直接接觸麥汁和啤酒，因此，都必須達(dá)到無(wú)菌要求，尤其要注意以下幾點(diǎn)：

①壓縮空氣（包括充氧和制氮?dú)庥茫┑臍庠�，�?yīng)當(dāng)在一定的高空中進(jìn)行采集。②氮?dú)庵苽浼鞍l(fā)酵CO2回收處理過(guò)程中，要特別加強(qiáng)除菌和除水控制。③氣路管道和過(guò)濾系統(tǒng)應(yīng)定期進(jìn)行CIP清洗和蒸汽反向滅菌。

（3）物料生產(chǎn)用原輔料、生產(chǎn)過(guò)程使用的添加劑、助濾劑、包裝物等物料都必須是安全衛(wèi)生的。必須加強(qiáng)進(jìn)廠入庫(kù)的檢測(cè)驗(yàn)收，以及使用前的檢驗(yàn)和必要的處理。

（4）酵母生產(chǎn)中必須使用無(wú)污染菌及野生酵母中新鮮、性能優(yōu)良的種酵母，對(duì)其加強(qiáng)擴(kuò)培、回收、添加等工序的衛(wèi)生管理。

（5）空間環(huán)境保持酵母儲(chǔ)存間、發(fā)酵間、清酒間、灌裝間等的空間潔凈，另外，如設(shè)置消毒池、安裝空調(diào)控制溫度、安裝紗門窗等措施，保持地面干燥，并定期對(duì)空間消毒，適時(shí)用漂白粉等洗刷地面。

（6）設(shè)備的保證：如漏點(diǎn)檢查，定期對(duì)生產(chǎn)設(shè)備進(jìn)行維護(hù)與維修，維修后及時(shí)進(jìn)行滅菌等。

5.2發(fā)酵過(guò)程的有害微生物控制

保證發(fā)酵液的無(wú)菌化是非常關(guān)鍵的一步，從麥汁充氧、酵母添加、冷凝固物排放、CO2回收、酵母回收、糖度檢測(cè)等全過(guò)程操作，都存在染菌的可能性，均應(yīng)有一定的保障性措施。

5.3過(guò)濾系統(tǒng)的優(yōu)化

（1）合適的過(guò)濾配比：硅藻土的粗細(xì)配比，對(duì)清酒含菌量有一定的影響，粗土過(guò)濾量大但卻未能讓啤酒酵母得到截留，對(duì)后面的除菌過(guò)濾造成壓力；細(xì)土有利于酵母截留但過(guò)濾量少。

（2）加強(qiáng)過(guò)濾助劑的管理

（3）過(guò)濾后機(jī)頭機(jī)尾酒液的處理要得當(dāng)5.4灌裝過(guò)程的嚴(yán)格監(jiān)控5.5清洗方案

針對(duì)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中各關(guān)鍵點(diǎn)微檢結(jié)果及殺菌效果的跟蹤出現(xiàn)的問(wèn)題，針對(duì)薄弱點(diǎn)調(diào)整CIP參數(shù)，改善清洗效果。

6.總結(jié)啤酒生產(chǎn)過(guò)程是一個(gè)微生物控制的系統(tǒng)工程，不但要從釀造工藝、設(shè)備、水質(zhì)、清洗等方面進(jìn)行全面分析，確定影響清酒微生物水平的因素，還需要員工有細(xì)致認(rèn)真的工作態(tài)度和良好的無(wú)菌操作意識(shí)、習(xí)慣，管理人員需要具有高度的敏感性，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)、解決問(wèn)題。

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