植物病理學(xué)實(shí)習(xí)總結(jié)

植物病理學(xué)實(shí)習(xí)總結(jié)

實(shí)習(xí)時(shí)間：一周

實(shí)習(xí)地點(diǎn)：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)校區(qū)及三區(qū)，毛莊，森林公園及浮

戲山

實(shí)習(xí)目的：學(xué)習(xí)實(shí)地認(rèn)識(shí)各種植物病害并采集標(biāo)本，學(xué)習(xí)制

作標(biāo)本的方法，學(xué)習(xí)用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌和細(xì)菌，學(xué)習(xí)制作玻片并觀(guān)察玻片來(lái)判斷病原物是什么。

實(shí)習(xí)中認(rèn)識(shí)的病害及病原物介紹：

1芍藥白粉病

癥狀：在葉面產(chǎn)生白色、近圓形的白粉狀霉斑，白斑向四周蔓延，連接成邊緣不整齊的大片白粉斑，其上布滿(mǎn)白色至灰白色粉狀物。葉上布滿(mǎn)白粉狀霉,即病菌的菌絲體、分生孢子梗及分生孢子。發(fā)病后期有時(shí)葉片上產(chǎn)生黑褐色小點(diǎn),為病菌的有性世代閉囊殼。2南瓜霜霉病

發(fā)病初期葉片背面出現(xiàn)水浸狀黃色斑點(diǎn)，病斑逐漸擴(kuò)大后，受葉脈限制呈黃褐色不規(guī)則的多角形病斑。在潮濕條件下，病斑背面長(zhǎng)有灰黑色霉層。發(fā)病重時(shí)，病

斑連成片，使葉片變黃干枯、易破碎，植株一片枯黃病原菌：真菌病害，病菌以在土壤或病株殘?bào)w上的孢子囊及潛

伏在種子內(nèi)的菌絲體越冬或越夏。以孢子囊隨風(fēng)雨進(jìn)行傳播，從寄主葉片表皮直接侵入，引起初次侵染，以后隨氣流和雨水進(jìn)行多次再侵染。

3番茄晚疫病

葉片染病多從葉尖、葉緣開(kāi)始病葉出現(xiàn)水浸狀暗綠色病

斑，當(dāng)向葉脈和莖蔓延后莖桿染病產(chǎn)生長(zhǎng)條狀暗褐色凹陷條斑。

病原物：致病疫霉菌，菌絲絲狀，分隔

4番茄早疫病

主要危害葉片，在莖基部產(chǎn)生暗褐色病斑，稍凹陷有輪紋。多從植株下部葉片向上發(fā)展，初呈水浸狀暗綠色病斑，擴(kuò)大后呈圓形或不規(guī)則形的輪紋斑，邊緣多具淺綠色或黃色的暈環(huán)，中部呈同心輪紋。

病原物：早疫病是由茄鏈格孢菌侵染所致，在真菌分類(lèi)中，屬于半知菌門(mén)鏈格孢屬。

番茄早疫病和番茄晚疫病的區(qū)別：番茄早疫病在生長(zhǎng)期都可

以發(fā)病。侵害葉、莖、果實(shí)各個(gè)部位，以葉片和莖葉分枝處最易發(fā)病。病害一般多從下部葉片開(kāi)始發(fā)生，逐漸向上擴(kuò)展。葉片上最初可見(jiàn)到深褐色小斑點(diǎn)，擴(kuò)大后呈圓形或近圓形，外圍有黃色或黃綠色的暈環(huán)，病斑灰褐色，有深褐色的同心輪紋，有時(shí)多個(gè)病斑連在一起，形成大形不規(guī)則病斑。番茄晚疫病在番茄的整個(gè)生育期均可發(fā)生，幼苗、莖、葉、和果實(shí)均可受害，以葉和青果受害為重。幼苗染病，病斑由葉向葉脈和莖蔓延，使莖變細(xì)并呈黑褐色，植株萎蔫或倒伏；葉片受害多從葉尖、葉緣開(kāi)始發(fā)病，初為暗綠色水浸狀不規(guī)則病斑，擴(kuò)大后轉(zhuǎn)為褐色。5煙草花葉病

葉脈兩側(cè)葉肉組織漸呈淡綠色。病毒在葉片組織內(nèi)大量增

殖，使部分葉肉細(xì)胞增大或增多，出現(xiàn)葉片薄厚不勻，顏色黃綠相間，呈花葉狀。后花葉斑駁程度加大，并現(xiàn)大面積深褐色壞死斑，中下部老葉尤甚，發(fā)病重的葉片皺縮、畸形。

病原物：有病毒引起

6洋蔥紫斑病

危害初期呈水浸狀白色點(diǎn)斑，病斑擴(kuò)大快，迅速形成寬1～

3厘米、長(zhǎng)2～4厘米紡錘形的凹陷斑，先為淡褐色，隨后變?yōu)楹稚�至晴紫色，周�(chē)�具有黃色暈圈。此后有的逐漸褪色并形成同心輪紋，濕度大時(shí)斑面上產(chǎn)生黑褐色煤粉狀霉。

病原菌稱(chēng)為蔥鏈格孢菌。

7梨銹病

葉片被害后葉片正面產(chǎn)生圓形小病斑，隨著病斑的擴(kuò)大，病斑中央產(chǎn)生蜜黃色微凸的小粒點(diǎn)（病菌性孢子器），潮濕時(shí)小粒點(diǎn)上溢出淡黃色黏液，之后病斑組織變肥厚，正面凹陷，背面隆起并長(zhǎng)出幾根至十幾根灰白色或淡黃色的細(xì)管狀物即銹孢子器，內(nèi)有大量褐色銹孢子，成熟后從銹孢子器頂端開(kāi)列散出。

病原物：病原屬擔(dān)子菌亞門(mén)膠柄銹屬真菌。性孢子器葫蘆形，埋生于表皮下；性孢子紡錘形，單胞無(wú)色。銹子器長(zhǎng)簡(jiǎn)形，叢生于葉背面。銹孢子近圓形，橙黃色，表面有瘤狀細(xì)胞。8花生褐斑病

初為褪綠小點(diǎn)，后擴(kuò)展成近圓形或不規(guī)則形小斑，病斑較黑斑病大而色淺，葉正面呈暗褐或茶褐色，背面呈褐或黃褐色，病斑周?chē)�有亮黃色暈圈。濕度大進(jìn)病斑上可見(jiàn)灰褐色粉狀霉層。

病原物：落花生尾孢，屬半知菌亞門(mén)真菌。子座多散生于病斑正面，深褐色。分生孢子梗叢生或散生于子座上，黃褐色，病菌以子座、菌絲團(tuán)或子囊腔在病殘?bào)w上越冬。翌年條件適宜，產(chǎn)生分生孢子，借風(fēng)雨傳播進(jìn)行初侵染和再浸染。菌絲直接伸入細(xì)胞間隙和細(xì)胞內(nèi)吸取營(yíng)養(yǎng)。9茄子黃萎病

初期葉緣及葉脈間出現(xiàn)褪綠斑,病株初在晴天中午呈萎蔫狀,早晚尚能恢復(fù),經(jīng)一段時(shí)間后不再恢復(fù),葉緣上卷變褐脫落,病株逐漸枯死,

病原物：茄子黃萎病病菌為半知菌門(mén)真菌的大麗輪枝菌，病菌分生孢子梗直立,細(xì)長(zhǎng),上有數(shù)層輪狀排列的小梗,梗頂生橢圓形、單胞、無(wú)色的分生孢子。10桃縮葉病

嫩葉剛伸出時(shí)就顯現(xiàn)卷曲狀，葉片逐漸開(kāi)展，卷曲及皺縮的程度隨之增加，致全葉呈波紋狀凹凸，嚴(yán)重時(shí)葉片完全變形。

桃縮葉病的病原物為畸形外囊菌。11黃瓜靶斑病

黃瓜靶斑病又稱(chēng)“黃點(diǎn)子病”，起初為黃色水浸狀斑點(diǎn)，發(fā)病中期病斑擴(kuò)大為圓形或不規(guī)則形，易穿孔，葉正面病斑粗糙不平，病斑整體褐色，中央灰白色、半透明。后期病斑直徑可達(dá)10~15毫米，病斑中央有一明顯的眼狀靶心。

病原物：由半知菌的棒孢菌引起的病害。12南瓜角斑病

主要為害葉片。葉片上產(chǎn)生多角形或不規(guī)則形病斑，受葉脈

限制。大小1～5毫米，初為淺褐色，后中間變灰白色，邊緣明顯，中心稍下凹，病斑周?chē)�不形成暈圈，后期病部正背長(zhǎng)出很多小黑點(diǎn)。嚴(yán)重時(shí)病斑融合成片，致葉片早枯。

病原菌：真菌半知菌門(mén)瓜角斑殼針孢。

在實(shí)習(xí)的過(guò)程中，我們認(rèn)識(shí)了很多植物病害，采集了很多標(biāo)本，對(duì)于不能肯定的植物病害，我們小組成員查閱了很多資料，并在玻璃皿中培養(yǎng)了許多未知病原物，然后分離出病原物，做成玻片在顯微鏡下觀(guān)察病菌形態(tài)，然后判斷是屬于那個(gè)門(mén)哪個(gè)科。我們還進(jìn)行了細(xì)菌和真菌的培養(yǎng)，分離土壤微生物。在實(shí)踐中，我們不僅學(xué)到了植物病害方面的知識(shí)，還增強(qiáng)了實(shí)際動(dòng)手操作能力。

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植物病理學(xué)實(shí)習(xí)總結(jié)報(bào)告

學(xué)院：資源環(huán)境學(xué)院年級(jí)：201*級(jí)

專(zhuān)業(yè)：植物保護(hù)微生物工程組別：第三小組姓名：戴澤翰學(xué)號(hào)：201*30201*08

指導(dǎo)老師：李敏慧、劉瓊光、周?chē)?guó)輝、徐大高、楊媚、

謝輝、何藝郡目錄

一、前言--------------------------------------------------------3二、實(shí)習(xí)目的與意義----------------------------------------3三、實(shí)習(xí)內(nèi)容與方法----------------------------------------3

實(shí)驗(yàn)一植物病害標(biāo)本的采集和制作------------4實(shí)驗(yàn)二植物病原的分離與培養(yǎng)-------------------8實(shí)驗(yàn)三植物病原真菌玻片標(biāo)本制作------------12實(shí)驗(yàn)四植物病原線(xiàn)蟲(chóng)的分離及形態(tài)觀(guān)察------14實(shí)驗(yàn)五植物病毒（香蕉束頂病毒）檢測(cè)------15四、實(shí)習(xí)（驗(yàn)）結(jié)果與分析------------------------------18五、收獲與體會(huì)----------------------------------------------19六、參考文獻(xiàn)-------------------------------------------------20

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植物病理學(xué)實(shí)習(xí)總結(jié)報(bào)告

戴澤翰201*30201*0808植保微生物1班

一、前言

植物病理學(xué)是主要研究引起農(nóng)作物病害發(fā)生的各種生物與非生物引子及其致病機(jī)制、病原物與寄主間相互關(guān)系和控制病害發(fā)生、減輕發(fā)病程度、減少病害所致?lián)p失的原理及具體措施的一個(gè)重要農(nóng)業(yè)學(xué)科。學(xué)習(xí)基本的植物病理學(xué)、流行學(xué)知識(shí)，掌握常見(jiàn)農(nóng)業(yè)病害鑒別和病原物采集、分離等技能，是對(duì)作為高等農(nóng)科院校植保專(zhuān)業(yè)學(xué)生提出的要求。為鞏固和印證所學(xué)的植物病理知識(shí)，增強(qiáng)學(xué)生對(duì)本地區(qū)主要作物及主要植物病害的直觀(guān)認(rèn)識(shí)，我校資環(huán)學(xué)院為植保專(zhuān)業(yè)安排了植物病理學(xué)課的實(shí)習(xí)，以加強(qiáng)學(xué)生理論結(jié)合實(shí)際，提高分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力，

二、實(shí)習(xí)目的與意義

(一)鞏固和印證所學(xué)植物病理學(xué)基礎(chǔ)理論知識(shí)(二)熟練掌握植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)操作技能

(三)通過(guò)室內(nèi)外觀(guān)察，認(rèn)識(shí)本地區(qū)主要作物及主要植物病害的形態(tài)特征(四)加強(qiáng)理論聯(lián)系實(shí)際，提高分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力

三、實(shí)習(xí)內(nèi)容與方法

(一)植物病害標(biāo)本的采集和制作及常見(jiàn)病害鑒定(二)植物病原的分離與培養(yǎng)

(三)植物病原真菌玻片標(biāo)本制作

(四)線(xiàn)蟲(chóng)病害標(biāo)本的采集、分離與鑒定(五)植物病毒（香蕉束頂病毒）檢測(cè)

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實(shí)驗(yàn)一植物病害標(biāo)本的采集和制作及常見(jiàn)病害鑒定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

植物病害標(biāo)本是植物病害及其分布的事務(wù)性記載，有了標(biāo)本即可在室外觀(guān)察的基礎(chǔ)上，開(kāi)展室內(nèi)各方面的工作，特別是病害診斷和病原物的分離鑒定工作，沒(méi)有合格的標(biāo)本更無(wú)從談起。因此，病害標(biāo)本的采集和制作是植物病害研究和實(shí)驗(yàn)的基本建設(shè)工作，植病標(biāo)本的采取和制作是植保人員必須掌握的的基本技術(shù)之一。通過(guò)本次標(biāo)本采集和制作實(shí)踐實(shí)習(xí)，學(xué)習(xí)標(biāo)本采集和制作的常用方法

二、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）標(biāo)本采集

1、外出實(shí)習(xí)地點(diǎn)(1)華農(nóng)大農(nóng)場(chǎng)

(2)華農(nóng)大增城寧西基地(3)廣州白云區(qū)蔬菜地

2、采集方式與標(biāo)本采集要求

(1)直接從病害植株以手、刀、剪刀提取病樣。

(2)癥狀應(yīng)具有典型性。標(biāo)本應(yīng)有典型的病狀和病癥，最好有不同階段和不同部位的癥狀。這樣才能使標(biāo)本起到幫助人們正確識(shí)別病害的作用。

(3)真菌病害標(biāo)本應(yīng)采集有子實(shí)體的。對(duì)于真菌病害來(lái)說(shuō)，鑒定病原物是正確診斷病害的重要條件之一，因此要求真菌病害標(biāo)本必須有病菌的子實(shí)體。

(4)每種標(biāo)本上的病害種類(lèi)應(yīng)力求單純。如果一份標(biāo)本上同時(shí)有幾種病害，就會(huì)混淆視線(xiàn)，影響鑒定，這樣就沒(méi)有適用價(jià)值。

(5)采集時(shí)應(yīng)進(jìn)行必要的記載，以輔助標(biāo)本不足。記載的內(nèi)容應(yīng)包括：寄主名稱(chēng)、發(fā)病情況、環(huán)境條件、以及采集日期、地點(diǎn)、采集人姓名等。

(6)寄主的鑒定也很重要，有些病害如銹病，不知道寄主是無(wú)法鑒定的。對(duì)于不認(rèn)識(shí)的寄主植物。應(yīng)將寄主鑒定所必需的部分，如枝、葉、花及果實(shí)等部分都采集齊全。(7)適于干制的標(biāo)本，應(yīng)隨采隨壓于標(biāo)本夾中，尤其容易干燥卷縮的標(biāo)本如水稻、小麥的葉片，最好立即夾在厚書(shū)本中，否則葉片失水卷縮后無(wú)法展平。

(8)柔軟多汁或腐爛的標(biāo)本，應(yīng)用紙袋或標(biāo)本紙包好，然后置于標(biāo)本箱中，以免污染和擠壞標(biāo)本，妨礙鑒定。

(10)黑白粉病、銹病、霜霉類(lèi)標(biāo)本等由于病菌孢子極易散落，所以采集時(shí)應(yīng)用紙袋或標(biāo)本紙包好后，再置于采集夾中或采集箱中，以免混雜妨礙鑒定。(11)每種標(biāo)本采集的數(shù)量不宜過(guò)少，以便在制作和應(yīng)用中留有余地。

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（二）標(biāo)本制作

1本實(shí)驗(yàn)采取干制法制作臘葉標(biāo)本。

2基本原理：利用標(biāo)本紙快速把病樣標(biāo)本脫水，并加壓把標(biāo)本壓成美觀(guān)的平面標(biāo)本。干燥愈快愈能保持標(biāo)本原有的色澤。

3操作：

（1）把適于壓制的病樣如植物的莖、葉以及去掉果肉的果皮等，整形后分層壓在標(biāo)本夾中，放一層標(biāo)本紙（每層3-4張）放一層標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本夾的總厚度以三寸左右厚為宜，用繩子將標(biāo)本夾壓緊。

（2）每隔一至兩天就打開(kāi)標(biāo)本夾檢查標(biāo)本紙的干濕程度，及時(shí)更換較濕的標(biāo)本紙。在第一次換紙時(shí)，同時(shí)將標(biāo)本整形，使其達(dá)到既美觀(guān)又便于觀(guān)察的要求。（3）將完全干燥的病樣標(biāo)本用透明膠、雙面膠等固定在白紙上，紙張右下角寫(xiě)上標(biāo)簽（標(biāo)簽內(nèi)容依次為寄主名稱(chēng)、病害名稱(chēng)、病原物中文名及拉丁文學(xué)名、采集地點(diǎn)、采集人姓名、采集日期、）

（三）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、制作了絲瓜霜霉病、玉米小斑病、水稻紋枯病、水稻白葉枯病、玉米黑粉病、茶輪斑病、竹黑痣病、玫瑰黑斑病、稻曲病的標(biāo)本。（見(jiàn)圖1-1,1-2）

圖1-15

圖1-2

2通過(guò)外觀(guān)形態(tài)觀(guān)察及顯微觀(guān)察結(jié)合，鑒定出了一些常見(jiàn)的病害：

病害名稱(chēng)水稻白葉枯病水稻細(xì)菌性條斑病玉米銹病玉米小斑病花生黑斑病花生銹病花生褐斑病南瓜花葉病毒病南瓜炭疽病萵苣霜霉病水稻紋枯病番茄晚疫病豇豆煤霉病辣椒炭疽病6

鑒定狀態(tài)已鑒定已鑒定未鑒定（顯微觀(guān)察僅見(jiàn)夏孢子）已鑒定已鑒定未鑒定（顯微觀(guān)察僅見(jiàn)夏孢子）未鑒定未鑒定未鑒定已鑒定已鑒定未鑒定未鑒定未鑒定絲瓜白粉病絲瓜炭疽病白菜軟腐病玉米大斑病茶炭疽病茶輪斑病茶白粉病茶藻斑病茶云紋葉枯病香蕉枯萎病水稻胡麻葉斑病芋疫病白菜霜霉病水稻葉鞘腐敗病白菜黑腐病茄褐紋病玫瑰黑斑病番茄早疫病甘藍(lán)黑腐病竹子黑痣病毛豆銹病已鑒定已鑒定已鑒定已鑒定已鑒定已鑒定已鑒定未鑒定已鑒定未鑒定已鑒定未鑒定已鑒定未鑒定已鑒定已鑒定已鑒定未鑒定已鑒定已鑒定未鑒定（顯微觀(guān)察僅見(jiàn)夏孢子）表1-1

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實(shí)驗(yàn)二植物病原的分離與培養(yǎng)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

在研究病原菌的形態(tài)、生理、生態(tài)以及病原菌對(duì)寄主植物的致病性等多種試驗(yàn)中，常常需要病原菌的純培養(yǎng)物。然而，在自然情況下，病原菌通常是與其他雜菌混生在一起的，從受病組織或其他基物中將病原菌單獨(dú)分選出來(lái)，叫作分離。分離和培養(yǎng)是植病實(shí)驗(yàn)室最基本的操作技術(shù)之一。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)植物病原菌分離培養(yǎng)的原理和常用的方法。

二、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

(一)清潔環(huán)境：

分離工作嚴(yán)格說(shuō)應(yīng)在無(wú)菌條下進(jìn)行，無(wú)菌室或無(wú)菌箱是分離不可缺少的設(shè)施。若限于條件實(shí)驗(yàn)只能在普通房間進(jìn)行時(shí)，必須對(duì)房間進(jìn)行徹底掃除，清潔環(huán)境、搞好衛(wèi)生。地上多灑些水，以消除室內(nèi)塵埃，分離開(kāi)始前準(zhǔn)備好一切用品，避免工作過(guò)程中頻繁走動(dòng)，以破壞環(huán)境帶來(lái)雜菌，工作臺(tái)上鋪好濕毛巾，點(diǎn)燃酒精燈。

(二)實(shí)驗(yàn)材料及用品準(zhǔn)備

1病組織材料

玉米小斑病病葉水稻紋枯病病葉水稻白葉枯病病葉

2用品準(zhǔn)備

0.1%升汞溶液(廣口瓶盛裝)；95%酒精(廣口瓶盛裝)；1000ppm鏈霉素；

瓶裝牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；瓶裝馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基；

此外，還有以下備品，無(wú)菌水1瓶，滅菌培養(yǎng)皿6付，滅菌1毫升吸管2支，解剖剪、解剖刀和鑷子各1把，移植環(huán)，移植鉤、酒精燈、琺瑯盤(pán)和試管架各1個(gè)，毛巾1條，玻璃鉛筆1支及火柴等。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）玉米小斑病與水稻紋枯病原分離（組織分離法）

1、取樣。取患玉米小斑病、水稻紋枯病的病樣，分別切取材料2~3mm長(zhǎng)的病健交界處。

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2、表面消毒。將病組織用清水洗凈，接著放到75%酒精里浸泡30s，然后放到0.1%升汞里浸泡0.5~1min，最后用無(wú)菌水洗3次。

3、培養(yǎng)。把材料放到PDA培養(yǎng)基上并在25℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)2~3天，觀(guān)察結(jié)果。

（二）水稻白葉枯病原分離（稀釋分離法）

1消毒：將剪下的植物組織用清水洗干凈，然后用75%的酒精浸泡30秒，在用0.1%的升汞洗0.5~1分鐘，最后用無(wú)菌水洗滌3次。2搗碎：取用一個(gè)滅菌小皿，向內(nèi)滴加1~2滴無(wú)菌水，然后滅菌剪刀剪碎已洗滌好的組織，放入水中靜置5-10分鐘，制備成菌懸液。

3劃線(xiàn)：用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液進(jìn)行平板劃線(xiàn)。

4培養(yǎng)：將平板倒置，寫(xiě)標(biāo)簽，至于28-30攝氏度培養(yǎng)，2天后，觀(guān)察分離結(jié)果。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

玉米小斑病分離培養(yǎng)的很成功，但水稻紋枯病全部都失敗了。

玉米小斑病病原平板培養(yǎng)菌落的形態(tài)見(jiàn)圖2-1。菌落大體呈圓形，營(yíng)養(yǎng)菌絲呈黑色，以接種樣葉為中心輻射生長(zhǎng)，菌落較大型�？拷�菌落中心長(zhǎng)有白色霉?fàn)钗铩?/p>

水稻紋枯病病菌分離培養(yǎng)失敗，我認(rèn)為有以下原因：首先、病樣選取有問(wèn)題。我們組選取的病葉保濕措施做得不夠好，病葉枯死面積大，雖實(shí)驗(yàn)過(guò)程盡量選取病健交界出，但是活菌數(shù)少；另外，基于全班只有少數(shù)幾個(gè)人做成功，我認(rèn)為可能位于采集地的病原菌處于不良環(huán)境或進(jìn)入菌落生長(zhǎng)的衰亡期，活菌數(shù)本身就不多；最后可能我們采取病樣的地方太單一，病樣葉均采自同一畝田。其菌落形態(tài)見(jiàn)圖2-2（引自第四組）。菌落大小中等，白色透明，背光難以看清，需置于深色背景以便觀(guān)察。菌落以接種葉樣為中心，自葉脈向外兩側(cè)呈放射狀生長(zhǎng)。

水稻白葉枯病病原為細(xì)菌，分離時(shí)采取劃線(xiàn)稀釋分離法。所有分離培養(yǎng)均成功，并取得了較好的單個(gè)菌落（見(jiàn)圖2-3,2-4）。水稻白葉枯病菌菌落較小，呈圓形，金黃色，半透明，表面光滑，向上隆突。

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圖2-1

圖2-2（引自第四組吳瀚嶸）

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圖2-3

圖2-411

實(shí)驗(yàn)三植物病原真菌玻片標(biāo)本制作

一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

觀(guān)察植物病原物的形態(tài)，進(jìn)行病原物的分類(lèi)鑒定，研究受病組織結(jié)構(gòu)病變、受病植物組織與病原物的解剖學(xué)關(guān)系以及病原物的保存?zhèn)溆玫龋�都需將材料制成適當(dāng)?shù)娘@微玻片標(biāo)本。因此，徒手制片技術(shù)也是植物病理學(xué)研究的重要手段之一。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)學(xué)習(xí)常用的徒手制片技術(shù)，為普通植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)的深入學(xué)習(xí)以及以后開(kāi)展病理學(xué)的有關(guān)研究工作奠定堅(jiān)實(shí)的制片技術(shù)基礎(chǔ)。

二內(nèi)容、材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料：美人蕉銹病病葉、竹子黑痣病病葉

實(shí)驗(yàn)器材：解剖針、剪刀、載玻片、蓋玻片、無(wú)菌水

三實(shí)驗(yàn)步驟

（一）美人蕉銹病病原裝片制作

1取美人蕉銹病病葉，用剃刀或解剖針輕輕掛取美人蕉葉背的黃色銹突，使銹突刮破并使刀片或針尖沾上黃色粉狀物。

2在載玻片上點(diǎn)一滴無(wú)菌水，將針尖或刀片浸于水中，使銹粉進(jìn)入漂散于水滴中。重復(fù)以上操作，待獲得足夠銹粉后，蓋上蓋玻片。3顯微鏡下觀(guān)察。

4鑒別結(jié)束后，將載玻片取走，風(fēng)干水分后，滴一滴綿藍(lán)乳酚油，蓋上蓋玻片，貼上標(biāo)簽。（二）竹子黑痣病病原裝片制作。

1取竹子黑痣病病葉，選取帶黑色突起較多的部位為切面，用刀片切取0.5*1cm規(guī)格的薄片。

2切得所需薄片后，置于滴有無(wú)菌水的載玻片上，蓋上蓋玻片。用鈍物輕輕壓平，置于顯微鏡下觀(guān)察。

3鑒別結(jié)束后，將載玻片取走，風(fēng)干水分后，滴一滴綿藍(lán)乳酚油，蓋上蓋玻片，貼上標(biāo)簽。

四實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖3-1

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圖3-1

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實(shí)驗(yàn)四線(xiàn)蟲(chóng)病害標(biāo)本的采集、分離與鑒定

一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

熟悉植物病原線(xiàn)蟲(chóng)的基本形態(tài)及其所致病害的癥狀特點(diǎn)，

學(xué)習(xí)土壤線(xiàn)蟲(chóng)的采集和分離，以及鑒定主要植物病原線(xiàn)蟲(chóng)的方法。常見(jiàn)線(xiàn)蟲(chóng)種類(lèi)的觀(guān)察

二內(nèi)容、材料和方法

塑料袋，鐵鏟，貝曼漏斗，解剖鏡，顯微鏡，培養(yǎng)皿，酒精燈，解剖針等

三實(shí)驗(yàn)步驟

1，采樣線(xiàn)蟲(chóng)多在植物生長(zhǎng)高峰期，多數(shù)為夏末秋初。豐富于根系土壤。采時(shí)運(yùn)用五點(diǎn)法，以植株為中心，取其根系五點(diǎn)取樣。取離地表10~20厘米深的土樣。每點(diǎn)取500~1000克，五點(diǎn)取后混勻，再倒出一些，最后取1000克。2，分離（貝曼漏斗法）

分離時(shí)在漏斗內(nèi)放大小適中的金屬網(wǎng)，篩上鋪紙巾，漏斗下面接橡皮管，橡皮管下接離心管，加樣本于網(wǎng)的紙巾上，以水淹沒(méi)后經(jīng)之。

3，鑒定經(jīng)過(guò)四個(gè)小時(shí)左右，取下離心管，再靜置十分鐘，吸去一半，把剩下的一半倒進(jìn)培養(yǎng)皿，因?yàn)榫�(xiàn)蟲(chóng)多數(shù)沉淀了。把培養(yǎng)皿置于解剖鏡下觀(guān)察，把線(xiàn)蟲(chóng)吸到玻片用低倍鏡觀(guān)察。4，殺滅治理把線(xiàn)蟲(chóng)置于酒精燈火焰上灼燒30~60秒，線(xiàn)蟲(chóng)即死亡。

四實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀(guān)察到較多無(wú)口針的腐生性線(xiàn)蟲(chóng)和少量的有口針的植物線(xiàn)蟲(chóng)，推測(cè)表明根部土壤附近含有大量線(xiàn)蟲(chóng)。在解剖鏡下線(xiàn)蟲(chóng)游動(dòng)或卷曲，并沉淀，死后即伸直。觀(guān)察到標(biāo)本滑刃線(xiàn)蟲(chóng)，墊刃線(xiàn)蟲(chóng)，螺旋線(xiàn)蟲(chóng)，紐帶線(xiàn)蟲(chóng)，腐生性線(xiàn)蟲(chóng)。

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實(shí)驗(yàn)五植物病毒（香蕉束頂病毒）檢測(cè)

一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

由于病毒甚為微小，在普通顯微鏡下看不到，也不能在一般培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所以通常只能靠病狀的表現(xiàn)及病毒的屬性，進(jìn)行診斷和鑒定。在某些植物的病組織中，在一定時(shí)間內(nèi)，尚能發(fā)生特殊的內(nèi)含體，也可作為鑒定上的參考。本實(shí)驗(yàn)的目的是識(shí)別植物病毒病的病狀類(lèi)型及其特點(diǎn)，了解病毒的一般性質(zhì)，學(xué)習(xí)病毒病害的鑒定方法及其原理。

二實(shí)驗(yàn)步驟

（一）CTAB法提取香蕉葉片總DNA

1、2%CTAB抽提緩沖液，用前加0.2~1%巰基乙醇）在65℃水浴鍋中預(yù)熱。2、取供試植物幼葉0.2g，置于研缽中加液氮研磨成粉末狀。

3、在液氮揮發(fā)將盡而植物組織尚未解凍時(shí)迅速加入600μL預(yù)熱的抽提緩沖液，稍作

研磨混勻

4、研磨液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，65℃水浴30~45min,期間不時(shí)搖勻。5、加入300μL飽和酚，300μL氯仿/異戊醇（24：1），劇烈振蕩2~3min,1200r/min，5min離心（室溫）

6、取上清液置于新的離心管中。加入等體積氯仿/異戊醇（24：1），溫和的混勻，1200r/min，5min離心（室溫）

7、取上清液置于新的離心管中。加入1/10體積3mol/LNaAc(pH5.2)和2倍體積冷無(wú)水乙醇，混勻，置于-20℃冰箱20min或過(guò)夜。8、4℃下1201*r/min，10min離心

9、棄上清液，沉淀分別用70%乙醇和無(wú)水乙醇各洗一次，室溫下風(fēng)干，溶于200μLTE或雙蒸水中，DNA制劑在4℃、-20℃、-70℃保存。

（二）PCR檢測(cè)

1、PCR管編號(hào)

2、配制反應(yīng)體系，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照（共3個(gè)反應(yīng)體系），配制如下：

DEPC水10×PCRBufferdNTPMix1個(gè)反映體系16.8μL2.5μL0.5μLn個(gè)反映體系n×16.8μLn×2.5μLn×0.5μL15

上游引物F下游引物RrTaq3、加DNA模板4、蓋緊PCR管，放入PCR儀，按所示程序進(jìn)行擴(kuò)增

1μL1μL0.2μLn×1μLn×1μLn×0.2μL

（三）PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳

1、1.2％瓊脂糖凝膠配制

稱(chēng)取1.2g瓊脂糖，溶于100mL0.5XTBE電泳工作液中，放入微波爐加熱熔化，室溫下冷卻至50℃左右，每配制100mL瓊脂糖加入5LEB替代物，混勻。

瓊脂糖凝膠緩慢倒入制膠槽內(nèi)，至膠厚約5mm，插上樣品梳，待其繼續(xù)冷卻至固體，拔去樣品梳。2、上樣

往電泳槽倒入0.5×TBE電極緩沖液（液面必須浸沒(méi)凝膠上表面）將瓊脂糖凝膠放入電泳槽中（由負(fù)極向正極電泳）用微量移液器吸取6LPCR產(chǎn)物與1L6Xloadingbuffer混合后，加入到凝膠上樣孔中，每樣品一個(gè)樣孔，并設(shè)分子量標(biāo)準(zhǔn)樣孔。3、電泳及結(jié)果觀(guān)察

將電泳槽與電泳儀相連接，接通電源（注意樣品孔須位于負(fù)極）

5V/cm電泳20～30min。電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，將制膠板從電泳槽中取出。取出膠塊置于凝膠成像系統(tǒng)或紫外光燈下觀(guān)察、照相。

三實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本組實(shí)驗(yàn)失敗了。紫外光燈下觀(guān)察瓊脂糖凝膠，可見(jiàn)本組試樣除了Marker顯色外，DNA樣品、陽(yáng)性、陰性均無(wú)顯色。

其他組的結(jié)果則為，第二組第一樣品顯色，陽(yáng)性沒(méi)顯色，但樣品條帶位置與五六組的陽(yáng)性相符，說(shuō)明香蕉束頂病毒DNA提取成功。五六組只有陽(yáng)性顯色，第四組與本組結(jié)果一樣。

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分析結(jié)果，可能有以下原因?qū)е聦?shí)驗(yàn)失敗。

1、實(shí)驗(yàn)原材料所帶此病毒較少。

2、葉片磨得不夠細(xì)，病毒DNA并未完全暴露或暴露較少。

3、加液氮研磨葉片時(shí)動(dòng)作較慢，未及時(shí)加入抽提緩沖液（已加入巰基乙醇），導(dǎo)致解凍后內(nèi)源

性Dnase降解基因組DNA。

4、CTAB法提取香蕉葉片總DNA過(guò)程第9步中，用70%乙醇和無(wú)水乙醇洗滌DNA沉淀后未完全風(fēng)

干即轉(zhuǎn)入低溫冷藏并用于PCR反應(yīng)，較高濃度乙醇使rTaq活性減弱，PCR反應(yīng)受阻。5、PCR中添加樣品與對(duì)照時(shí)溶液不均勻?qū)е虏�沒(méi)吸取到所需DNA。

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四實(shí)習(xí)心得和體會(huì)

在我看來(lái)，兩個(gè)星期的植物病理學(xué)實(shí)習(xí)，對(duì)于我們來(lái)說(shuō)，是一次洗禮，是一次轉(zhuǎn)折。得益于學(xué)院安排給我們植保專(zhuān)業(yè)的脫課實(shí)習(xí)，我們跳出了課堂，擺脫了枯燥無(wú)味的書(shū)本，獲得了在大自然這個(gè)大課室中學(xué)習(xí)的機(jī)會(huì)。在這次長(zhǎng)達(dá)兩個(gè)星期的實(shí)習(xí)中，我獲益良多，有知識(shí)的增長(zhǎng)、技能的提高，有意志的鍛煉、耐心的考驗(yàn)、更有對(duì)我們心思縝密度的挑戰(zhàn)、邏輯。但最讓我覺(jué)得重要的是，我意識(shí)到了兩樣品質(zhì)對(duì)的一個(gè)科研人員的重要性：嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度和團(tuán)體合作精神。

1外出實(shí)習(xí)，多知覺(jué)的學(xué)習(xí)眼看，手觸，耳聽(tīng)日本的川島隆太教授認(rèn)為，包含多種知覺(jué)信息的集合對(duì)人腦刺激是最大的。為什么人們喜歡看3D電影？因?yàn)轸酆狭寺暪庑Ч�的信息媒體會(huì)讓我們記得更深，腦波頻振動(dòng)更大！以前上課，一節(jié)課的幻燈片下來(lái)，我們記下了多少頁(yè)？但實(shí)習(xí)結(jié)束后，至少我還記得玉米葉子上的銹突握在手里的感覺(jué)。不下田，某些城市來(lái)的同學(xué)甚至不知道辣椒長(zhǎng)啥樣，雖然在樹(shù)上看過(guò)。而在田間聽(tīng)老師講病理生理學(xué)、病害流行學(xué)、分類(lèi)學(xué)知識(shí)似乎好玩得多。2實(shí)驗(yàn)技能扎實(shí)提升

兩個(gè)星期的實(shí)驗(yàn)，使我們的實(shí)驗(yàn)技能有了長(zhǎng)足提升。在某些方面的知識(shí)，比如說(shuō)田間病樣采集的常識(shí)還有土壤線(xiàn)蟲(chóng)的采樣與分離方法等，在之前近乎為零。分離純培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)操作則是功課重溫，使我們的這些技能更扎實(shí)。3意志、耐性、細(xì)膩

每一天的外出和每一天的實(shí)驗(yàn)都是對(duì)我們意志的考驗(yàn)，采樣的路不可能永遠(yuǎn)都是好走的，實(shí)驗(yàn)不可能永遠(yuǎn)都是易做易成功的。讓我記憶猶新的是竹子黑痣病切片制作的艱辛。整整一個(gè)下午了，我們都糾結(jié)在一塊小小的竹葉上。人道讀萬(wàn)卷書(shū)，走萬(wàn)里路，我們都是切了一萬(wàn)個(gè)切片了，就是鮮有成功。那是對(duì)人注意力、小腦平衡力的挑戰(zhàn)，大抵是我做實(shí)驗(yàn)以來(lái)做使人眼酸手累的活兒了。但是過(guò)幾天當(dāng)我再次撿起刀片的時(shí)候，解剖鏡下我的手似乎沒(méi)有那么抖了。

4團(tuán)結(jié)，就是力量

我們可以一個(gè)人做好一個(gè)實(shí)驗(yàn)，但不可能寫(xiě)好一篇文章，哪位科學(xué)家敢敢說(shuō)自己從來(lái)不看參考的文獻(xiàn)？人的思維是有死角的，對(duì)于一位科研人員來(lái)說(shuō)，心思必須盡量縝密，做事和計(jì)劃要力圖巨細(xì)無(wú)遺，但對(duì)于一個(gè)人來(lái)說(shuō)，要求其做到完美無(wú)錯(cuò)似乎是對(duì)他吹毛求疵。因而，思想的交流是我們成功的必經(jīng)之途。團(tuán)隊(duì)協(xié)作的重要性，是我在資料整理、PPT制作以及寫(xiě)這篇總結(jié)報(bào)告中感受最深的一樣?xùn)|西。某個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗了，為什么失敗，哪一點(diǎn)遺漏了呢，你為什么認(rèn)為是這個(gè)原因呢：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不足了，結(jié)果與分析寫(xiě)不出來(lái)了，可以讓我看看你們組的嗎，可以引用一下你們組的圖片嗎，你的分析有點(diǎn)道理哦……有了伙伴，我們不需要一個(gè)人對(duì)著一大堆數(shù)據(jù)糾結(jié)了，我們不需要一個(gè)人完成一個(gè)80頁(yè)的PPT了，我們不需要為自己1個(gè)小時(shí)都切不到合適的切片供觀(guān)察而煩惱，總會(huì)有人相機(jī)里有相應(yīng)的照片，總會(huì)有人這個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟中這個(gè)藥劑的用途，總會(huì)……如果你認(rèn)為我們會(huì)有抄襲之嫌那就錯(cuò)了。我們厭惡自己的智力勞動(dòng)成果被竊取，誰(shuí)也不喜歡自己熬費(fèi)苦心想出來(lái)的分析被人簡(jiǎn)單的一個(gè)粘貼就拿走了……總而言之，teamwork是如此之重要，我們會(huì)發(fā)揚(yáng)下去！

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六、問(wèn)題和建議

1希望能增加做實(shí)驗(yàn)或?qū)嵙?xí)的時(shí)間。農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)是一門(mén)理論與實(shí)踐聯(lián)系很強(qiáng)的學(xué)科，離開(kāi)田間搞研究只不過(guò)是紙上談兵。好比學(xué)一門(mén)外語(yǔ)，學(xué)好一門(mén)外語(yǔ)、最好的方法就是使用它。

2本次實(shí)習(xí)安排得不甚嚴(yán)謹(jǐn)。比如說(shuō)需要無(wú)菌操作的地方?jīng)]用提供無(wú)菌操作臺(tái)，又比如發(fā)給學(xué)生的實(shí)習(xí)指導(dǎo)上未必全有都與實(shí)際操作相符的信息。誠(chéng)然，迫于經(jīng)費(fèi)和和時(shí)間、空間的原因，我們不能做到像諸位老師真正搞科研時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件。但是，實(shí)驗(yàn)既要求，又鍛煉科研人員嚴(yán)謹(jǐn)、認(rèn)真、細(xì)膩的治學(xué)態(tài)度。若實(shí)驗(yàn)本身就漏洞百出，豈不是與培養(yǎng)學(xué)生具有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲袘B(tài)度、治學(xué)精神的初衷相違嗎？為什么有些同學(xué)上了大學(xué)后覺(jué)得大學(xué)不外如是，為什么有些同學(xué)四年后覺(jué)得自己沒(méi)學(xué)到應(yīng)該學(xué)到的東西呢？為什么老師總是不滿(mǎn)學(xué)生素質(zhì)和知識(shí)不足呢？有自身興趣、學(xué)習(xí)態(tài)度等方面的原因，是否也有教學(xué)方式和動(dòng)機(jī)不符的惡性循環(huán)的原因呢？

3嘗試大膽些，讓學(xué)生們完全支配一個(gè)實(shí)驗(yàn)。為什么我們都認(rèn)為美國(guó)的大學(xué)好？因?yàn)槊绹?guó)的本科教育極力抵制專(zhuān)業(yè)知識(shí)的抗拒，而是重視技能的培養(yǎng)，他們會(huì)讓學(xué)生完全計(jì)劃和進(jìn)行一個(gè)科研項(xiàng)目，從立項(xiàng)、儀器的準(zhǔn)備，用品用量的計(jì)算和安排，到實(shí)驗(yàn)的執(zhí)行、數(shù)據(jù)的處理等等，讓學(xué)生全權(quán)包辦。不放心學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能？害怕學(xué)生搞砸了浪費(fèi)經(jīng)費(fèi)？那是因?yàn)闆](méi)有讓學(xué)生肩負(fù)過(guò)責(zé)任，大綱為我們做，原理為我們找，材料為我們安排好，我們只需要遵循實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)做就可以了，我們有時(shí)甚至不需不知道做每一步的原因是什么。迫于教學(xué)資源分配和設(shè)施、計(jì)劃的時(shí)限等等原因，我們不能做到世界一流大學(xué)的水平，但是否有一些除了硬件以外的地方我們可以做得比他們好呢？

一點(diǎn)拙見(jiàn)，望老師笑涵。

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七、參考文獻(xiàn)

賴(lài)傳雅等.201*.農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)華南本第二版.北京:科學(xué)出版社陳利鋒等.201*.農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)第3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社

趙亞華.201*.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程.北京：高等教育出版社許志剛.201*.普通植物病理學(xué).北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社徐文耀.201*.賀運(yùn)春.201*.

普通植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)北京：科學(xué)出版社，植物病害制片技術(shù)北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社

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